顧海英，鄭紅霞，路陽(yáng)陽(yáng)，胡海群，李玥玥，張 麗，賀亞男，吳奇涵

（華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062）

0 引 言

皮膚癌是一種比較常見(jiàn)的腫瘤［1］．近年來(lái)，皮膚癌的發(fā)病率有不斷上升的趨勢(shì)，人的皮膚、頭發(fā)，眼睛顏色及皮膚對(duì)于陽(yáng)光的敏感度等表型特征與皮膚癌的易感性相關(guān)［2］．個(gè)體皮膚、頭發(fā)和眼睛顏色差異主要由黑色素生成量、黑色素的類型及在體表的分布決定［3］．研究表明，黑色素生成通路中的相關(guān)基因的多態(tài)性（包括MC1R，OCA2，MATP，ASIP和TYR）可能會(huì)影響個(gè)體皮膚、頭發(fā)、眼睛顏色特征及對(duì)皮膚癌的易感性［4］．

黑色素有兩種，真黑素和棕黑色素，后者比例高會(huì)使皮膚呈較淺膚色，對(duì)陽(yáng)光較為敏感，皮膚癌的易感性也會(huì)增加［5］．MC1R基因（黑素皮質(zhì)素受體1）在黑色素生成網(wǎng)絡(luò)中具有關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用［6］．該基因只有一個(gè)外顯子，高度多態(tài)，約100多個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其編碼區(qū)的多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與皮膚對(duì)于陽(yáng)光照射的敏感性表型（紅發(fā)、白皙皮膚和雀斑）及皮膚癌的易感性有關(guān)［7］．西方人群紅發(fā)、白皙皮膚、雀斑和藍(lán)色眼睛等表型明顯，皮膚對(duì)于陽(yáng)光照射敏感，皮膚癌的發(fā)病率比亞洲和非洲高，目前對(duì)該基因研究主要集中在歐美及澳洲人群，在亞洲人群類似研究較少．除本實(shí)驗(yàn)室外，在中國(guó)人群中關(guān)于該基因多態(tài)的報(bào)道僅有兩篇［8，9］，并且尚無(wú)與色素表型的關(guān)聯(lián)分析研究．

基于該基因在黑色素合成過(guò)程中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用，有必要在中國(guó)人群中研究該基因多態(tài)性及其與膚色、頭發(fā)顏色、雀斑、對(duì)陽(yáng)光的敏感性方面的關(guān)聯(lián)性．本實(shí)驗(yàn)室自2009年開始該項(xiàng)研究，鄭紅霞等人以MC1R為研究對(duì)象，通過(guò)非條件邏輯回歸（Unconditional logistic regression）對(duì)MC1R基因與發(fā)色及皮膚表型特征的關(guān)聯(lián)度進(jìn)行定量研究［10］，本文在此基礎(chǔ)上對(duì)樣本統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行了改進(jìn)，并結(jié)合國(guó)內(nèi)外最新的研究成果，為后續(xù)皮膚癌檢測(cè)及診療手段研究提供參考．

1 材料與方法

1．1 研究對(duì)象

本研究包括251名皮膚健康的正常人群，他們是無(wú)任何血緣關(guān)系的漢族人群，來(lái)自全國(guó)各地，在上海生活至少一年以上．樣本收集周期是2009年9月至2010年3月．參與研究人員同意參加此次研究并簽署知情同意書，填寫皮膚等級(jí)評(píng)定表，樣本收集的反饋率是96．5%（251／260）．所有參與者都是在校大學(xué)生，年齡在18～25周歲，以室內(nèi)工作生活為主，無(wú)皮膚病史，無(wú)吸煙、酗酒等不良生活習(xí)慣．

1．2 特征評(píng)定

皮膚顏色評(píng)定采用雅芳化妝品公司提供的肌膚顏色測(cè)試卡（見(jiàn)圖1A），評(píng)定工作由3人獨(dú)立完成，結(jié)果一致方采納，不一致則去除該樣本．頭發(fā)顏色評(píng)定采用頭發(fā)顏色樣板卡（見(jiàn)圖1B），評(píng)定工作同樣由3人獨(dú)立完成．同時(shí)參與者根據(jù)自己的實(shí)際情況填寫問(wèn)卷．訪問(wèn)完成后，個(gè)體提供口腔脫落細(xì)胞作為進(jìn)一步提取基因組DNA分析的樣本．

圖1 皮膚（A）和頭發(fā)（B）顏色測(cè)試卡Fig．1 Frameworks of skin（A）and hair（B）colour test card

1．3 樣本信息統(tǒng)計(jì)

根據(jù)調(diào)查問(wèn)卷信息對(duì)環(huán)境因素（包括居住地，雀斑情況，戶外活動(dòng)情況，電腦使用情況，熬夜情況）整理劃分．根據(jù)樣本信息問(wèn)卷，同時(shí)參照Fitzpatrick皮膚分類［11，12］，對(duì)樣本的皮膚表型特征分類．皮膚顏色按等級(jí)分為兩大類：一類為皮膚顏色較淺組（包括前1—3級(jí)）；一類為皮膚顏色較深組（包括4—8級(jí)）．皮膚對(duì)陽(yáng)光的敏感性評(píng)定參照Fitzpatrick［11］，皮膚對(duì)陽(yáng)光的敏感性分為兩類：一類為較敏感型（評(píng)分為1—6分）；一類為不敏感型（評(píng)分為7—10）．雀斑情況分為兩大類：一類為無(wú)雀斑，一類為有雀斑（輕微雀斑和很多雀斑）．頭發(fā)顏色分類中，由于自然黑占整個(gè)樣本人群的61．9%（86／139），因此對(duì)頭發(fā)顏色分兩種情況進(jìn)行討論：一種是頭發(fā)顏色較淺組（包括自然黑和淺黑）和頭發(fā)顏色較深組（濃黑）；一種是頭發(fā)顏色較深組（包括自然黑和濃黑）和頭發(fā)顏色較淺組（淺黑）．

1．4 基因型分析

個(gè)體提供的口腔脫落細(xì)胞作為進(jìn)一步提取基因組DNA分析的樣本，采用改進(jìn)的酚氯仿法提取基因組［13］，以基因組DNA為模板擴(kuò)增MC1R基因編碼區(qū)片段并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序（由華大基因公司完成）．MC1R基因擴(kuò)增引物采用文獻(xiàn)［14］中的MC1R基因擴(kuò)增引物MC1R－F：5′－GGAAGAACTGTGGGGACCTGGAG－3′；MC1R－R：5′－TAAGGAACTGCCCAGGGTCACAC－3′．

將割膠回收得到的純PCR產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序引物為F：5′－CACTCACCCATGTACTGC－3′．將測(cè)序得到的序列通過(guò)在線Blast2sequence初步篩出多態(tài)位點(diǎn)，通過(guò)Chromas軟件打開序列峰圖，確定多態(tài)位點(diǎn)的基因型．通過(guò)序列比對(duì)及測(cè)序結(jié)果峰圖判斷，在MC1R基因的編碼區(qū)共得到7個(gè)SNP位點(diǎn)．這7個(gè)核酸位點(diǎn)在MC1R基因編碼區(qū)的位置分別為200、274、359、421、488、497及942．

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS軟件（SPSS v16．0）以非條件邏輯回歸模型（Unconditional logistic regression）分析各個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與皮膚顏色、皮膚對(duì)陽(yáng)光的敏感性、雀斑情況以及頭發(fā)顏色關(guān)聯(lián)度，以所得的比值比（Odds ratios，ORs）及其95%的置信區(qū)間（Confidence intervals，CIs）表示結(jié)果．P＜0．05表示差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié) 果

2．1 樣本信息統(tǒng)計(jì)及分類

在最初參與實(shí)驗(yàn)的251人中，樣本信息完整，發(fā)色及皮膚顏色評(píng)定結(jié)果一致的共149人，成功進(jìn)行SNP分型的為139例樣本，成功率95．5%．樣本的基本信息及各因素與表型特征的關(guān)聯(lián)程度見(jiàn)表1．在性別因素與各種表型的關(guān)聯(lián)分析中，與女性相比，男性皮膚更容易合成黑色素（P＜0．001，OR＝9．05，95%CI：3．75～21．83），男性不易形成雀斑（P＝0．001，OR＝0．26，95%CI：0．12～0．59）．環(huán)境因素與各種表型的關(guān)聯(lián)分析中，戶外活動(dòng)情況與皮膚顏色具有顯著相關(guān)性（P＜0．05）．皮膚對(duì)于陽(yáng)光敏感性和頭發(fā)顏色表型與性別及環(huán)境因素沒(méi)有相關(guān)性．

表1 性別及環(huán)境因素與表型特征的關(guān)聯(lián)程度表Tab．1 Association between the phenotypic characteristics and the gender and environmental factors

2．2 MC1R基因中的SNP位點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)中，在MC1R基因的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)7個(gè)SNP位點(diǎn)（見(jiàn)表2）．在MC1R基因編碼區(qū)的位置分別為200、274、359、421、488、497及942，第421位SNP在SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有報(bào)道．第497位SNP在數(shù)據(jù)庫(kù)中雖有報(bào)道，在中國(guó)漢族人群中首次發(fā)現(xiàn)其具有多態(tài)性．

表2 MC1R基因SNP點(diǎn)統(tǒng)計(jì)表Tab．2 Information of SNPs in MC1Rcoding region in our research

2．3 SNP與各種表型特征的關(guān)聯(lián)性

對(duì)較小等位基因頻率較高的4個(gè)位點(diǎn)（c．274G＞A，c．359T＞C，c．488G＞A，c．942A＞G）與皮膚顏色、皮膚對(duì)陽(yáng)光的敏感性、雀斑情況以及頭發(fā)顏色進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)合表1的結(jié)論，選擇影響表型的其它因素納入校正，頭發(fā)顏色關(guān)聯(lián)度分析中需加入性別及戶外活動(dòng)時(shí)間校正因素，雀斑情況關(guān)聯(lián)度分析中需加入性別校正因素，其余的無(wú)校正因素．結(jié)果如表3所示．

結(jié)合環(huán)境因素對(duì)皮膚顏色及雀斑情況與SNP關(guān)聯(lián)度情況進(jìn)行多因素分析，c．942A＞G與皮膚顏色具有相關(guān)性，與野生基因型AA相比，其突變純合基因型GG與較淺膚色顯著相關(guān)（P＝0．044，OR＝0．16，95%CI：0．03～0．95）．而c．488G＞A與頭發(fā)顏色具有相關(guān)性，與野生型純合子GG相比，其突變雜合基因型AG能顯著加深發(fā)色（P＝0．049，OR＝2．68，95%CI：1．01～7．12）．另外，c．359T＞C測(cè)序結(jié)果僅有兩種基因型（TT，TC），與野生基因型TT相比，其雜合基因型TC雀斑發(fā)生機(jī)率提高了5．76倍（P＝0．040，OR＝5．76，95%CI：1．05～31．53）

表3 SNP與皮膚表型特征及頭發(fā)顏色關(guān)聯(lián)性分析Tab．3 Association between the phenotypic characteristics and SNP of MC1R

續(xù)表3

3 討 論

本研究首次在中國(guó)漢族人群中選擇MC1R基因編碼區(qū)的多態(tài)位點(diǎn)為研究對(duì)象，分析其與中國(guó)漢族人群的皮膚顏色、皮膚對(duì)陽(yáng)光的敏感性、雀斑情況及頭發(fā)顏色的關(guān)聯(lián)性．在歐洲人群（包括英國(guó)、荷蘭、意大利、德國(guó)、希臘、西班牙、愛(ài)爾蘭和波蘭等）［15，16］、美國(guó)人群［17］及澳大利亞［18］人群中，該基因與皮膚表型的關(guān)聯(lián)性已進(jìn)行過(guò)分析．研究位點(diǎn)主要集中在以下9個(gè)：c．178G＞T，c．252C＞A，c．274G＞A，c．425G＞A，c．451C＞G，c．464T＞C，c．478C＞T，c．488G＞A和c．880G＞C．2008年Sara Raimondi的meta分析［19］中總結(jié)得出：c．252C＞A，c．425G＞A，c．451C＞G，c．478C＞T和c．880G＞C，這5個(gè)位點(diǎn)與紅色頭發(fā)（Red hair colour，RHC表型）顯著相關(guān)，被定義為RHC多態(tài)位點(diǎn)，其中后3個(gè)為強(qiáng)RHC位點(diǎn)，前兩個(gè)較弱．強(qiáng)RHC位點(diǎn)（c．451C＞G，c．478C＞T和c．880G＞C）除與紅色頭發(fā)有關(guān)，也與白皙皮膚有關(guān)，它們與黑色素瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)．c．252C＞A和c．425G＞A這兩個(gè)位點(diǎn)與黑素瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)性的相關(guān)性存在爭(zhēng)議．在NCBI（美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心）dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中，不同種族人群中這5個(gè)RHC位點(diǎn)的較小等位基因的頻率（MAF）相差較大．但總體而言，西方人群中RHC表型位點(diǎn)MAF遠(yuǎn)高于亞洲人群．亞洲人群體表特征的色素差異較小，皮膚癌發(fā)病率比西方人群低，可能與RHC位點(diǎn)的頻率低有關(guān)．

共有251人（中國(guó)，漢族）參與此次研究，139例樣成功進(jìn)行SNP分型，在中國(guó)漢族人群的MC1R基因編碼區(qū)中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)SNP位點(diǎn)（c．200G＞A，c．274G＞A，c．359T＞C，c．421G＞A，c．488G＞A，c．497C＞G，c．942A＞G），對(duì)較小等位基因頻率較高的四個(gè)位點(diǎn)（c．274G＞A，c．359T＞C，c．488G＞A，c．942A＞G）與皮膚顏色、皮膚對(duì)陽(yáng)光的敏感性、雀斑情況及頭發(fā)顏色之間的關(guān)聯(lián)度進(jìn)行了多因素非條件邏輯回歸分析．研究表明，除了c．274G＞A位點(diǎn)，其余3個(gè)位點(diǎn)都與色素表型顯著相關(guān)．c．274G＞A與c．488G＞A是高度多態(tài)的位點(diǎn)，頻繁出現(xiàn)在西方及亞洲人群中，與RHC表型沒(méi)有絕對(duì)關(guān)聯(lián)性．2009年，Perez Oliver等人［20］總結(jié)了已發(fā)現(xiàn)的MC1R基因編碼區(qū)的一些SNP位點(diǎn)的功能特點(diǎn)，c．274G＞A的突變會(huì)導(dǎo)致棕黑色素合成增加，使皮膚呈現(xiàn)較淺膚色，降低黑素細(xì)胞對(duì)于紫外線的防御作用，增加皮膚對(duì)于陽(yáng)光的敏感性，它與黑素瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)性仍存在爭(zhēng)議．在我們的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中，雖然該位點(diǎn)突變純合子在淺膚色人群比例比野生純合子要多兩倍多，但沒(méi)有顯著相關(guān)性（P＞0．05），需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證．與野生基因型GG相比，c．488G＞A的突變純合子AA與非RHC表型相關(guān)，并可增加黑素瘤及其它皮膚癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［7，19，20］．本研究中，c．488G＞A的突變雜合基因型AG與較深發(fā)色（自然黑＋濃黑）顯著相關(guān)（P＜0．05），但野生純合子GG并未表現(xiàn)出陽(yáng)性結(jié)果，從OR值可以看出，與野生純合子GG相比，該位點(diǎn)的突變純合子AA在較深發(fā)色（自然黑＋濃黑）組中也多了近一倍，這與前人的研究結(jié)果相符合．c．359T＞C，c．942A＞G是研究較少的位點(diǎn)，幾乎沒(méi)有文章涉及到其功能研究．MC1R蛋白是一個(gè)多功能蛋白，其編碼區(qū)的多態(tài)位點(diǎn)與皮膚癌發(fā)生相關(guān)，并不僅僅是通過(guò)黑色素合成通路實(shí)現(xiàn)的，也有可能通過(guò)MC1R蛋白的其它功能途徑如DNA修復(fù)等實(shí)現(xiàn)，由此可能與其他疾病發(fā)生相關(guān)［21］．Wu GS等人在研究MC1R基因編碼區(qū)的多態(tài)位點(diǎn)與抑郁癥的關(guān)聯(lián)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，c．942A＞G和c．274G＞A均與抑郁癥的藥物治療反應(yīng)有關(guān)，基因芯片功能分析結(jié)果表明，這兩個(gè)位點(diǎn)能夠影響MC1R蛋白功能．此外，他們還發(fā)現(xiàn)c．488G＞A與抑郁癥發(fā)生顯著相關(guān)［22］（P＝0．040）．

本研究中發(fā)現(xiàn)的7個(gè)SNP位點(diǎn)中，c．200G＞A，c．274G＞A，c．359T＞C，c．488G＞A，c．942A＞G這5個(gè)位點(diǎn)已有報(bào)道［23］，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新SNP：c．421G＞A，首次在中國(guó)漢族人群中發(fā)現(xiàn)c．497C＞G．這兩個(gè)位點(diǎn)的突變均為異義突變，由此可能會(huì)影響MC1R蛋白的功能及結(jié)構(gòu)．在本實(shí)驗(yàn)中，由于兩個(gè)位點(diǎn)的MAF較低，未對(duì)其功能進(jìn)行進(jìn)一步的分析，其后續(xù)的功能論證還有待進(jìn)一步論證．

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