馬旭兵，翟萬銀，張嘉敏，朱自嚴，張紅鋒，常 江

（1．華東師范大學 生命科學學院，上海 200062；2．中國科學研究院 上海市硅酸鹽研究所高性能與超微結構國家重點實驗室，上海 200050；3．上海市血液中心，上海 200051）

0 引 言

心臟瓣膜病是一種致命的嚴重疾病，自20世紀60年代臨床上采用戊二醛（Glutaraldehyde，GA）交聯制備的生物瓣作置換手術以來，已成功挽救或延長了數以百萬計的患者生命［1，2］．該方法制備的生物瓣具有供體來源豐富、方法簡單、免疫原性較低、中心血流通暢、不需終身服用抗凝劑等優(yōu)點［1，2］，但仍存在嚴重的缺點，如鈣化和GA緩慢釋放所產生的細胞毒性［1，2］等，限制了其體內使用壽命和進一步的臨床應用［2］．目前研究集中于新交聯劑或GA交聯改性的探索，如采用京尼平［3］、槲皮素［4］和碳二亞胺［5］等新型交聯劑或采用鋁離子［2］、單寧酸［6］和鈦納米涂層［7］等改進的GA交聯方法等處理心臟瓣膜，可部分改善生物瓣膜的性能，但至今尚未見到相關的臨床應用研究．

近年來，我們發(fā)現原花青素（Procyanidins，PC）可通過氫鍵交聯瓣膜細胞外基質，可有效抑制其鈣化和提高穩(wěn)定性［8，9］．此外，PC本身還具有多種生物活性，如抗菌、抗血栓和抑制免疫原性等［10－13］，因而有可能較好地改進GA交聯瓣膜的缺陷．本研究采用PC與GA共交聯豬主動脈脫細胞瓣膜材料，評價了該材料的細胞相容性、血液相容性以及免疫原性，以期在保留GA交聯的優(yōu)良性能的基礎上，消除或改進其缺陷．

1 材料與方法

1．1 脫細胞豬心臟瓣膜制備

新鮮豬心臟取自上海復新屠宰場，放置于冰袋中運輸至實驗室．無菌條件下剪取主動脈瓣瓣葉，4℃下無鈣、鎂平衡鹽溶液（D－Hanks液）充分清洗，按照文獻報道方法脫除瓣膜細胞成分［8］，再經充分清洗制備成脫細胞豬心臟瓣膜材料備用．

1．2 瓣膜間質細胞的分離與培養(yǎng)

瓣膜間質細胞（Heart valve interstitial cells，HVICs）按照文獻報道方法分離培養(yǎng)［14］．新鮮豬主動脈瓣膜經D－Hanks液充分洗滌后剪成約1mm3小塊，加入用D－Hanks液配制的0．25%胰蛋白酶（Sigma，USA）5mL，37℃恒溫消化5min，取出以D－Hanks液清洗，去除內皮細胞，再加入1．5mg／mL的Ⅱ型膠原酶（Sigma，USA，D－Hanks液配制）5mL，37℃消化1h即得到含有原代HVICs的細胞懸液．經離心（Jouan A14，France）、清洗5次，所得原代HVICs加入含20%胎牛血清（四季青）及100U／mL雙抗的DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，Gibco，USA）培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱（MEMMERT，France）中培養(yǎng)．細胞貼壁生長至90%培養(yǎng)皿底面時傳代培養(yǎng)，第3～5代的HVICs用于本研究實驗．

1．3 交聯劑配比的確定

由于瓣膜共交聯后兩種交聯劑可能同時以低濃度緩慢釋放，所以本研究將GA臨床常用濃度（6．25mg／mL）與PC有效交聯濃度（10mg／mL）以PC／GA分別為80∶20、60∶40、50∶50、40∶60和20∶80的不同配比混合后，稀釋至50倍，作用于HVICs，觀察不同配比混合交聯劑對細胞增殖的抑制率．選擇對細胞增殖抑制率最低的配比作為共交聯方法中兩種交聯劑的最優(yōu)配比．將HVICs以5×103細胞／孔接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)液換為含有不同配比的混合交聯劑的新鮮培養(yǎng)液，以不含交聯劑的細胞培養(yǎng)液作空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)72h．用MTT法檢測各實驗組對HVICs的增殖抑制．細胞增殖率（Relative viability of HVICs）計算公式為：細胞增殖率%＝（實驗組OD值／空白對照組OD值）×100%．

1．4 脫細胞心臟瓣膜的交聯制備

將瓣膜材料隨機分為4組：a）不交聯組（Control）；b）以6．25mg／mL GA交聯組（GA6）；c）以10mg／mL PC交聯組（PC10）；d）以采用1．3所述方法選定的混合配比的共交聯組，即8mg／mL PC與1．25mg／mL GA共交聯組（P8G1）．所有交聯液均用pH 7．4的D－Hanks液配制，交聯過程均在37℃、120r／min的搖床中完成．b）和c）組分別采用6．25 mg／mL GA溶液和10mg／mL PC溶液交聯48h．d）組采用8mg／mL PC溶液交聯4h后，再用1．25mg／mL GA溶液繼續(xù)交聯至48h．交聯的各組瓣膜材料充分洗滌后以4℃的DHanks液保存?zhèn)溆茫鲜龈鹘M每組6個脫細胞瓣膜葉片．將未交聯和交聯后的脫細胞豬心臟瓣膜材料鋪展在藍色紙上，用數碼相機拍攝瓣膜材料的宏觀形態(tài)．

1．5 細胞相容性評價

采用瓣膜材料表面種植HVICs、計算細胞粘附率以評價交聯瓣膜的細胞相容性．交聯瓣膜各組樣品（n＝4）材料剪成直徑為10mm的圓片，瓣膜材料褶皺多的一面向上放置于48孔板中．培養(yǎng)液將HVICs稀釋成104細胞／mL細胞懸液，每孔加細胞懸液100μL，培養(yǎng)16h．取出瓣膜材料用D－Hanks液漂洗3遍，洗去未粘附細胞，經固定、梯度酒精脫水、干燥后，300倍下掃描電鏡觀察、每個樣品任選4個視野拍照用于粘附細胞計數，以實驗組4個視野平均粘附細胞數相對于不交聯組的細胞數作為細胞相對粘附率（Relative adhesion）．相對粘附率按下式計算：

相對粘附率%＝（各交聯組平均粘附細胞數／對照組平均粘附細胞數）×100%．

1．6 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察

將樣品浸泡在濃度為2．5%戊二醛的D－Hanks溶液中固定4h．此后用D－Hanks溶液洗滌3次，然后依次浸泡于一系列梯度濃度的乙醇溶液中（乙醇的體積分數分別為30%，50%，70%，90%，95%和100%），每個濃度10min，使之脫水．接著將樣品浸入體積分數為50%的六甲基二硅胺烷（HMDS）—乙醇溶液中干燥10min，然后放入純的HMDS中干燥10min，最后放入通風櫥中通風揮發(fā)干燥過夜，干燥樣品噴金用于電鏡觀察．

1．7 溶血實驗

新鮮抗凝血液（上海市血液中心提供）以2 000r／min離心10min，棄掉上清，沉淀用DHanks液重懸清洗3次，最后用D－Hanks液按1∶10稀釋后備用．取稀釋后的血液300μL分別加入：?1 200μL超純水（陽性對照）；?1 200μL無菌D－Hanks液（陰性對照）；?—?各材料組1 200μL懸液，即分別含不交聯組瓣膜材料和GA6，P8G1和PC10交聯組瓣膜材料碎末（＜1mm3）的D－Hanks液配制的懸液．輕輕混勻，室溫放置2h后4 000r／min離心2min，使用數碼相機拍攝各實驗組的溶血狀況照片；取離心后各組上清用酶聯免疫檢測儀（ELX800，BIO－TEK，USA）于541nm下測定其吸光度．按下式計算樣品的溶血率（Hemolysis Rate）：

溶血率%＝［（樣品OD值－陰性OD值）／（陽性OD值－陰性OD值）］×100%．

1．8 血小板粘附

脫細胞交聯瓣膜各組樣品（n＝4）材料剪成直徑為10mm的圓片，皺褶多的一面向上放置于48孔板中，每孔加入200μL血小板（106血小板／mL，上海市血液中心提供）孵育1h．棄掉孵育后的血小板溶液，SEM觀察瓣膜材料表面血小板粘附狀況，放大2 000倍下每樣品隨機選取4個視野拍照，用于粘附的血小板計數，取平均值后用于表征瓣膜材料的抗血栓形成能力．血小板粘附數量越多表示材料形成血栓的可能性越大；反之，粘附數量越少則表示材料的抗血栓能力越強．

1．9 單核巨噬細胞的粘附

THP－1細胞是人急性白血病單核細胞株（human acute monocytic leukemia cell lines，上海市血液中心提供），經佛波酯（phorbol 12－myristate 13－acetate，PMA）誘導分化可形成具有貼附生長能力的巨噬細胞，其對材料的粘附可以表征此材料的免疫原性［15，16］．THP－1以106細胞／mL培養(yǎng)于12孔板中，RPMI－1640培養(yǎng)液中加入誘導劑100ng／mL的PMA培養(yǎng)48h，使之誘導分化為巨噬細胞．D－Hanks液洗去未貼壁細胞，收集巨噬細胞并用培養(yǎng)液稀釋成106細胞／mL．各組瓣膜材料樣品（n＝4）剪成直徑為10mm的圓片，皺褶多的一面向上放置于48孔板中，每孔接種200μL稀釋后巨噬細胞懸液，培養(yǎng)16h后D－Hanks液洗去未粘附細胞，瓣膜材料經固定、脫水、干燥后，SEM觀察巨噬細胞粘附狀況．另取200倍下SEM照片作如1．8所述計數、計算粘附率．巨噬細胞粘附率越高表示材料潛在的免疫原性越高；反之，粘附率越低則表示材料潛在的免疫原性越低．粘附率（Cell adhesion）按下式計算：

粘附率%＝（各交聯組平均粘附細胞數／對照組平均粘附細胞數）×100%．

1．10 統(tǒng)計分析

所有實驗數據用Student t－test分析軟件統(tǒng)計分析，分析結果用平均數（mean）±標準差（SD）表示．統(tǒng)計學方法采用t檢驗檢測組間差異，p＜0．05表示組間有顯著性差異，p＜0．01表示組間有極顯著差異．

2 實驗結果

2．1 共交聯劑配比及交聯濃度的確定

如圖1所示，不同混合比例配制的兩種交聯劑混合液對細胞的增殖抑制作用隨著GA比例的減少和PC比例的增加而降低．當PC和GA濃度以160μg／mL和25μg／mL混合時，即混合比例為80∶20時，對細胞增殖的抑制作用最小．因此，本研究采用此對細胞增殖抑制最小的交聯劑濃度配比，再結合GA臨床常用交聯濃度6．25mg／mL和PC有效交聯濃度10mg／mL，確定后續(xù)共交聯方法中PC與GA分別以8mg／mL和1．25mg／mL的濃度交聯瓣膜材料．為敘述簡潔，該共交聯方法標記為P8G1．

圖1 相同稀釋比例的各共交聯液對于HVICs增殖情況的影響Fig．1 Cell viability of HVICs cultured in co－crosslinking reagents with same dilution ratio

2．2 脫細胞及交聯的心臟瓣膜形貌

脫細胞瓣膜經交聯后，不交聯（control）、6．25mg／mL GA交聯（GA6）、共交聯（P8G1）以及10mg／mL PC（PC10）交聯瓣膜的宏觀形貌如圖2中上圖所示．脫細胞未交聯瓣膜呈白色半透明狀，基本保持正常形態(tài)結構，稍有收縮．GA6交聯瓣膜顏色呈淡黃色，形態(tài)輕度皺縮、僵硬．與其相比，P8G1與PC10交聯瓣膜因PC（PC溶液呈褐色）參與交聯而呈淡褐色和深褐色，形態(tài)柔軟無明顯皺縮．由于PC本身顏色呈褐紅色，P8G1與PC10交聯瓣膜因PC含量影響而呈淡褐紅色和深褐紅色，有少量褶皺，顯示所交聯的瓣膜柔軟，無明顯收縮．圖2中下圖所示為各組瓣膜的微觀形貌，顯示各組瓣膜基質纖維完整、無明顯斷裂．其中脫細胞不交聯組及P8G1與PC10組纖維完整較松軟，而GA6組則明顯緊密，可能是GA6組宏觀形貌較僵硬的原因．

圖2 交聯的脫細胞瓣膜宏觀照片（上）和微觀形貌SEM圖（下）Fig．2 The photos（above）and SEM images（below）of crosslinked AHVM

2．3 細胞相容性

采用瓣膜表面種植HVICs來評價交聯瓣膜材料的細胞相容性．從圖3A可以看出，對照組粘附細胞數量較多，形態(tài)伸展呈梭形或多邊形，有較多偽足．而GA6交聯瓣膜材料只有少量細胞粘附，且有部分細胞已破裂．P8G1和PC10交聯瓣膜材料表面粘附細胞數量相當，且形態(tài)均呈圓形或剛伸出偽足．細胞計數統(tǒng)計結果（見圖3B）顯示：與對照組（100%）相比，GA6交聯瓣膜材料粘附的細胞量僅為（19．75±3．27）%；P8G1和PC10交聯瓣膜材料的粘附量分別為（78．75±8．7）%、（98．21±4．42）%．這一結果說明P8G1交聯瓣膜材料的細胞相容性介于GA6交聯瓣膜材料與PC10交聯瓣膜材料之間，且極顯著高于GA6．

圖3 各交聯組瓣膜材料表面粘附HVICs的SEM照片（A）和相對粘附率（B）Fig．3 SEM images（A）and relative adhesion of（B）HVICs on crosslinked AHVM

2．4 溶血

如圖4右上角插圖所示，正常（陰性對照）無溶血現象，血液離心后紅細胞沉降與EP管底部，上清液中沒有血紅素，而陽性對照由于紅細胞破裂，大量血紅素溶解于上清液中．與陽性對照組相比，各實驗組瓣膜材料上清液中幾乎沒有血紅素，無明顯的溶血發(fā)生．溶血實驗的定量結果顯示：各實驗組的溶血率均極顯著的低于陽性對照組（純水）．Control、GA6、P8G1和PC10各組交聯瓣膜材料的溶血率分別為（0．36±0．116）%、（0．42±0．3）%、（0．75±0．36）%、（0．72±0．58）%，均遠低于國際標準ISO 10993－4：2002所規(guī)定的血液相容性標準最大溶血率5%［17］．雖然與GA6相比，P8G1和PC10交聯瓣膜材料的溶血率略有上升，但是并不存在統(tǒng)計學差異．

圖4 各交聯組瓣膜材料的溶血率Fig．4 Hemolysis rates of AHVM

2．5 血小板粘附

圖5A所示為血小板粘附于各實驗組瓣膜材料表面的掃描電鏡照片．如圖，大量血小板粘附于GA6交聯瓣膜材料表面，而P8G1和PC10交聯瓣膜材料表面僅粘附少量血小板．如圖5B，對粘附血小板計數統(tǒng)計進一步驗證了這一結果：PC10交聯瓣膜材料的血小板粘附數量與對照組和GA6交聯瓣膜均存在顯著性差異（p＜0．05）．P8G1交聯組瓣膜材料粘附的血小板數量與對照組相當，但顯著低于GA6交聯瓣膜（p＜0．05）．

2．6 免疫原性評價

瓣膜的免疫原性取決于瓣膜殘留的免疫表位的多少，免疫表位越多越有利于巨噬細胞粘附，因此瓣膜單位面積粘附的巨噬細胞數量能夠反映瓣膜免疫原性的強弱．圖6A所示為巨噬細胞粘附于各交聯瓣膜材料的掃描電鏡圖．如圖所示，Control和GA6交聯瓣膜材料表面粘附的巨噬細胞粘附數量相當，但是細胞形態(tài)差異明顯：對照組粘附細胞形態(tài)開始伸展有少量偽足，GA6組粘附細胞形態(tài)未伸展呈圓形．與GA6相比，粘附于P8G1與PC10交聯瓣膜材料表面的巨噬細胞數量明顯減少．圖6B的粘附率結果顯示：4組瓣膜材料均可粘附一定數量的巨噬細胞，其中PC10交聯瓣膜材料粘附率較低，雖然P8G1粘附率較PC10交聯瓣膜高，但是顯著低于GA6交聯瓣膜材料．

圖5 各交聯組瓣膜材料表面血小板粘附SEM照片（A）和粘附量（B）Fig．5 SEM images（A）and number（B）of platelet adhesion for crosslinked AHVM

3 討 論

GA是目前較常用的交聯劑，廣泛應用于生物瓣交聯制備［1］．20世紀80年代發(fā)現，GA可與膠原蛋白分子的N末端氨基、ε－氨基和羥基等反應形成共價鍵，使膠原蛋白分子間形成網狀交聯［1］．與GA交聯方式不同，PC主要通過其酚羥基與膠原蛋白中羥脯氨酸羥基、ε－氨基和酰胺羰基等基團形成氫鍵交聯［8］．本研究中通過這兩種機理不同的交聯劑共交聯處理的生物瓣，在保留了GA交聯的一些優(yōu)良性能的基礎上，克服了GA交聯引起的幾項缺點．

低毒性為理想生物瓣所必須［2］．GA的游離醛基具有較強的細胞毒性，GA作為交聯劑因其在交聯的材料中可以緩慢釋放，因而可引起一定的細胞毒性［1］．共交聯P8G1組瓣膜顯示無收縮，較柔軟，其所帶褐紅色為PC本身顏色，而PC是一種廣泛存在于各種食物中，具有多種生物活性的黃酮類化合物［8］．研究表明，PC的毒性遠低于GA，僅為相同濃度GA的1%［8］．本研究采用PC與GA共交聯的方法即瓣膜先經8mg／mL PC交聯，再經1．25mg／mL GA交聯的方法，降低了GA的使用量（為GA單獨交聯濃度的1／5）從而減弱了交聯后的釋放量，降低了細胞毒性．相同稀釋比例的共交聯液對細胞的增殖抑制率（55%）遠低于GA（82%）．細胞相容性實驗中，與對照組粘附細胞形態(tài)伸展、伸出偽足相比，共交聯瓣膜材料表面粘附細胞雖然鋪展較慢，僅部分伸出少量偽足，但細胞沒有破裂，形態(tài)明顯好于GA6交聯組．此外共交聯瓣膜材料表面粘附的相對細胞量（78%）約為GA單獨交聯（19%）的4倍，顯示共交聯瓣膜的細胞相容性遠高于GA單獨交聯的瓣膜，具有較好的細胞相容性．

圖6 各交聯組瓣膜材料表面粘附的巨噬細胞SEM照片（A）與粘附率（B）Fig．6 SEM images（A）and cell adhesion rate（B）of immunogenicity evaluation for crosslinked AHVM

生物瓣植入體內后與血液直接接觸，因此血液相容性是衡量生物瓣材料能否臨床應用的重要指標之一［2］．溶血試驗是血液相容性評價的經典實驗方法，也是血液相容性評價方法中的唯一國家標準所采用的方法，主要是檢測瓣膜材料對血液中紅細胞的溶血作用［18］．當血液相容性差的物質與血液中的紅細胞接觸后，會引起紅細胞膜破裂，釋放出細胞內的血紅蛋白，發(fā)生溶血．通過測定某物質引起的血紅蛋白釋放量，可以表征該物質的溶血率．血液相容性較好的材料應具有較低的溶血率．本研究中，共交聯瓣膜材料幾乎沒有溶血現象發(fā)生，溶血率僅為0．7%，與GA交聯組相當，都遠低于國際標準ISO 10993－4：2002所規(guī)定的血液相容性標準所允許的5%［17］，符合醫(yī)用生物瓣的要求．

血小板粘附性能實驗是研究生物瓣血液相容性的重要內容之一，因為血小板粘附、聚集是材料表面血栓形成過程中重要的一步［3］．有研究報道PC可以減少血小板聚集，進而抑制血栓形成［12］，其作用機制可能與PC的強抗氧化性能有關．本研究血小板粘附實驗結果中，PC交聯瓣膜單位面積粘附的血小板數量（95個）遠小于GA交聯瓣膜（293個），顯示PC單獨交聯瓣膜可以有效減少血小板粘附，從而抑制血栓形成，具有較強的抗血栓形成的潛能．共交聯瓣膜由于PC的前交聯處理，血小板粘附量（193個）介于PC交聯瓣膜與GA交聯瓣膜之間，同樣具備抗血栓形成的潛能．雖然共交聯瓣膜抗血栓形成的能力不及PC單獨交聯瓣膜，但是卻明顯高于GA單獨交聯瓣膜．本研究從溶血和血栓形成兩個方面證明了共交聯瓣膜具有較好的血液相容性．

理想生物瓣必須在植入人體后不能引起明顯的免疫排斥反應［2］．研究發(fā)現，脫細胞處理瓣膜可去除引起免疫排斥反應的細胞成分，可有效地降低瓣膜的免疫原性［19］．有文獻報道GA可以掩蓋相關抗原，進而降低GA交聯生物瓣的免疫原性［1，20］．但是，2003年Simon等［21］發(fā)現GA交聯的脫細胞生物瓣給兒科四例患者置換后，有三位因異體脫細胞瓣膜存在免疫反應，并在術后一年內死亡．看來脫細胞和GA交聯還不足以完全消除免疫原性的隱患．因此，進一步降低或消除脫細胞生物瓣的免疫原性顯得尤為重要．本研究中共交聯瓣膜的巨噬細胞粘附率顯著低于GA交聯的瓣膜，表明其潛在免疫原性低于GA單獨交聯．這可能是由于具有抑制免疫原性的PC［13］的加入而實現的優(yōu)良效果．

4 結 論

綜上所述，PC與GA共交聯的豬脫細胞心臟瓣膜材料細胞相容性遠高于GA單獨交聯的瓣膜材料，具有較低的細胞毒性．該共交聯瓣膜材料不引起溶血，具有一定的抗血栓形成潛能，顯示了良好的血液相容性．同時與GA交聯效果相比，共交聯瓣膜材料的免疫原性也顯著降低．可見，PC與GA共交聯作為制備人工生物瓣膜材料的新方法，很有可能應用于臨床瓣膜置換術的生物瓣制備．

［1］JAYAKRISHNAN A，JAMEELA S R．Glutaraldehyde as a fixative in bioprostheses and drug delivery matrices［J］．Biomaterials，1996，17：471－484．

［2］SCHOEN F J，LEVY R J．Tissue heart valves：Current challenges and future research perspectives［J］．J Biomed Mater Res，1999，47：439－465．

［3］CHANG Y，HSU C K，WEI H J，et al．Cell－free xenogenic vascular grafts fixed with glutaraldehyde or genipin：In vitro and in vivo studies［J］．J Biotechnol，2005，120：207－219．

［4］ZHAI W，L X，CHANG J，et al．Quercetin－crosslinked porcine heart valve matrix：Mechanical properties，stability，anticalcification and cytocompatibility［J］．Acta Biomater，2010（6）：389－395．

［5］SCHMIDT C E，BAIER J M．Acellular vascular tissues：Natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering［J］．Biomaterials，2000，21：2215－2231．

［6］ISENBURG J C，SIMIONESCU D T，VYAVAHARE N R．Tannic acid treatment enhances biostability and reduces calcification of glutaraldehyde fixed aortic wall［J］．Biomaterials，2005，26：1237－1245．

［7］NORBERT W G，HANGORG Z，HANS H S．Nano－coating with titanium of glutaraldehyde－fixed heart valve prostheses enables a reduced immune response and a self－seeding within circulation［G］／／DANIEL E．Regenerative Medicine and Tissue Engineering－Cells and Biomaterials．Rijeka：InTech，2011．

［8］ZHAI W，CHANG J，LIN K，et al．Crosslinking of decellularized porcine heart valve matrix by procyanidins［J］．Biomaterials，2006，27：3684－3690．

［9］ZHAI W，CHANG J，LüX，et al．Procyanidins－crosslinked heart valve matrix：Anticalcification effect［J］．J Biomed Mater Res B，2009，90B：913－921．

［10］FURIGA A，LONVAUD F，BADET C．In vitro study of antioxidant capacity and antibacterial activity on oral anaerobes of a grape seed extract［J］．Food Chem，2009，113：1037－1040．

［11］SIVAKUMARAN S，MOLAN A L，MEAGHER L P，et al．Variation in antimicrobial action of proanthocyanidins from Dorycnium rectumagainst rumen bacteria［J］．Phytochemistry，2004，65：2485－2497．

［12］SANO T，ODA E，YAMASHITA T，et al．Anti－thrombotic effect of proanthocyanidin，apurified ingredient of grape seed［J］．Thromb Res，2005，115：115－121．

［13］LIU Y Z，CAO Y G，YE J Q，et al．Immunomodulatory effects of proanthocyanidin A－1derived in vitro from Rhododendron spiciferum［J］．Fitoterapia，2010，81：108－114．

［14］JOHNSON C M，HANSON M N，HELGESON S C．Porcine cardiac valvular subendothelial cells in culture－cell isolation and growth－characteristics［J］．J Mol Cell Cardiol，1987，19：1185－1193．

［15］BRODBECK W G，NAKAYAMA Y，MATSUDA T，et al．Biomaterial surface chemistry dictates adherent monocyte／macrophage cytokine expression in vitro［J］．Cytokine，2002，18：311－319．

［16］李相仕．殼聚糖基生物材料與巨噬細胞相互作用研究［D］．天津：天津大學，2007．

［17］BLAZSO G，GABOR M，ROHDEWALD P．Antiinflammatory activities of procyanidin－containing extracts from Pinus pinaster Ait after oral and cutaneous application［J］．Pharmazie，1997，52：380－382．

［18］劉興光，汪鋼，俞世強，等．組織工程心臟瓣膜支架材料的血液相容性［J］．中國臨床康復，2004，8（30）：6659－6661．

［19］ZHOU J Y，FRITZE O，SCHLEICHER M，et al．Impact of heart valve decellularization on 3－D ultrastructure，immunogenicity and thrombogenicity［J］．Biomaterials，2010，31：2549－2554．

［20］OKAMURA K，CHIBA C，IRIYAMA T，et al．Antigen depressant effect of glutaraldehyde for aortic heterografts with a valve，with special reference to a concentration right fit for the preservation of grafts［J］．Surgery，1980，87：170－176．

［21］SIMON P，KASIMIR M T，SEEBACHER G，et al．Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT（TM）in pediatric patients［J］．Eur J Cardio－Thorac Sur，2003，23：1002－1006．