劉繼紅，蘇 青

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院 老年科，上海 200240;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 內(nèi)分泌科，上海200240)

全世界糖尿病尤其是2型糖尿病患病率以驚人的速度在流行，全世界糖尿病患者人數(shù)將從2000年的1.5億上升到2025年的3億［1］。糖尿病通常伴隨著長期的微血管、神經(jīng)、大血管并發(fā)癥，嚴(yán)格的糖尿病治療獲得理想的血糖控制能減少這些并發(fā)癥的發(fā)生?？诜堤撬幨潜仨毜?，其中50年前問世的磺脲類抗糖尿病藥物通過刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素調(diào)節(jié)血糖，至今仍是2型糖尿病的一線口服降糖藥。然而大量的研究表明這類藥物(氯磺丙脲、格列本脲)在改善糖尿病的血糖控制，積極影響微血管并發(fā)癥發(fā)展的同時(shí)，隨著治療時(shí)間的延長，胰島β細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，功能逐漸出現(xiàn)衰竭。Tsubouchi等［2］報(bào)道治療濃度的格列本脲同高糖一樣通過依賴蛋白激酶C(PKC)激活NAD(P)H，使β細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，生成活性氧(ROS)。格列吡嗪和格列奇特同格列本脲一樣屬于第二代磺脲類藥物，臨床治療糖尿病后都出現(xiàn)藥物繼發(fā)性失效，可能是磺脲類藥物對胰島剩余β細(xì)胞的有害作用導(dǎo)致β細(xì)胞最終耗竭［3］，也可能是高血糖對胰島β細(xì)胞的葡萄糖毒性作用致胰島素分泌日益減少［4］。是否都是因?yàn)檠趸瘧?yīng)激產(chǎn)生的ROS進(jìn)一步造成細(xì)胞凋亡呢?我們以格列吡嗪和格列奇特作用于MIN6細(xì)胞，同樣通過觀察細(xì)胞活力、細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化情況、細(xì)胞凋亡情況，探討第二代磺脲類藥物對胰島β細(xì)胞的影響，進(jìn)一步明確不同磺脲類藥物對β細(xì)胞影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 MIN6細(xì)胞株(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院李小英教授饋贈)、格列吡嗪(上海集團(tuán)信宜制藥總廠提供)、格列奇特(上海匯仁制藥有限公司提供)，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法 MIN6細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基中。每2天換液，每4～5天傳代1次。分別取0、1 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L 格列吡嗪和格列奇特干預(yù)MIN6細(xì)胞24 h后，用MTT法檢測細(xì)胞活力變化，運(yùn)用ROS捕獲劑雙氫溴乙啶(HE)、雙氫-乙酰乙酸二氯熒光黃(DCFH-DA)和雙氫羅丹明123(DHR123)孵育細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光、流式細(xì)胞儀檢測MIN6細(xì)胞的MFI而測得細(xì)胞內(nèi)ROS水平。用Annexin-vFITC和PI雙標(biāo)記細(xì)胞凋亡檢測法通過流式細(xì)胞儀測定藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況。取10 μmol/L格列吡嗪和格列奇特分別干預(yù)MIN6細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，運(yùn)用上述同樣方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，分別行F檢驗(yàn)。P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 格列吡嗪及格列奇特對MIN6細(xì)胞活力的影響 與正常對照組比較，格列吡嗪組細(xì)胞活力下降，差異顯著，說明格列吡嗪影響β細(xì)胞功能，且隨作用時(shí)間延長，細(xì)胞活力影響越大，見表1。格列奇特處理組各時(shí)間和濃度點(diǎn)活力均無明顯下降，見表2。

表1 MTT法檢測格列吡嗪對MIN6細(xì)胞活力影響(OD，±s)

表1 MTT法檢測格列吡嗪對MIN6細(xì)胞活力影響(OD，±s)

與對照組相比＊＊P＜0.01

24 h 48 h 72 h對照組(n=5)組別＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 0.879 ±0.025 0.838 ±0.037 0.860 ±0.042 glip 1 μmol/L 組(n=5)0.686 ±0.045＊＊ 0.604 ±0.009＊＊ 0.542 ±0.010＊＊glip 10 μmol/L 組(n=5)0.604 ±0.155＊＊ 0.543 ±0.012＊＊ 0.497 ±0.013＊＊glip 50 μmol/L 組(n=5)0.497 ±0.013＊＊ 0.402 ±0.013＊＊ 0.396 ±0.006＊＊F 值 19.41 374.60 388.11 P值

表2 MTT法檢測格列奇特對MIN6細(xì)胞活力影響(OD，±s)

表2 MTT法檢測格列奇特對MIN6細(xì)胞活力影響(OD，±s)

24 h 48 h 72 h對照組(n=5)組別0.879 ±0.025 0.838 ±0.037 0.860 ±0.042 glic 1 μmol/L 組(n=5)0.857 ±0.035 0.864 ±0.045 0.851 ±0.045 glic 10 μmol/L 組(n=5)0.876 ±0.045 0.856 ±0.034 0.855 ±0.056 glic 50 μmol/L 組(n=5)0.867 ±0.048 0.875 ±0.054 0.849 ±0.038 F 值 0.318 0.651 0.055 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

2.2 活性氧(ROS)捕獲及檢測

2.2.1 熒光顯微鏡 用10 μmol/L HE孵育各組格列吡嗪培養(yǎng)基MIN6細(xì)胞1 h后，熒光顯微鏡下結(jié)果顯示與正常組相比，作用48 h下細(xì)胞內(nèi)的熒光增強(qiáng)，而格列奇特組作用48 h下細(xì)胞內(nèi)的熒光無明顯增強(qiáng)，見圖1。

2.2.2 流式細(xì)胞儀

2.2.2.1 格列吡嗪藥物對MIN6 ROS產(chǎn)生的影響

2.2.2.1.1 48 h 正常 MIN6 細(xì)胞內(nèi) Rh123 的 MFI為50.8 ±8.5，格列吡嗪藥物濃度分別為 1 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L 培養(yǎng)基培養(yǎng) MIN6 細(xì)胞 MFI分別為 78.5 ± 7.3、110.6 ±9.9、156.4 ±14.5，結(jié)果顯示:與正常對照組比較差異顯著，且隨著濃度的增加，藥物作用下的細(xì)胞內(nèi)ROS生成明顯增加(F=94.86，P ＜0.01)。

2.2.2.1.2 正常 MIN6 內(nèi) Rh123 的 MFI在 24 h、48 h、72 h 分別為48.9 ±5.9、55.3 ±6.1、50.8 ±6.5，含格列吡嗪10 μmol/L藥物的DMEM培養(yǎng)相同時(shí)間后，MFI分別為 90.8 ± 10.2、125.8 ±11.8、162.8 ±15.2，與正常對照組比較差異顯著，結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)隨著時(shí)間的延長，格列吡嗪作用下的細(xì)胞內(nèi)ROS 生成明顯增多(F=22.32，P ＜ 0.01)，見圖2。

2.2.2.2 格列奇特對MIN6細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響格列奇特藥物濃度分別為 1 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L培養(yǎng)基培養(yǎng)MIN6細(xì)胞MFI分別為50.5±6.4、59.6 ±7.1、55.7 ±6.9。結(jié)果顯示:與正常對照組比較無明顯差異，并予10 μmol/L格列奇特同時(shí)孵育24 h、48 h、72 h，細(xì)胞內(nèi)MFI無明顯降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.18，P ＞0.05)，見圖3。

圖1 熒光顯微鏡下HE探針染色MIN6細(xì)胞熒光×200A:對照組熒光強(qiáng)度;B:10 μmol/L格列吡嗪培養(yǎng)MIN6的熒光強(qiáng)度;C:10 μmol/L格列奇特培養(yǎng)MIN6的熒光強(qiáng)度

圖2 格列吡嗪不同時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞Rh123的MFI

圖3 不同濃度格列吡嗪和格列奇特培養(yǎng)細(xì)胞Rh123的MFI

2.3 細(xì)胞凋亡的檢測

2.3.1 熒光顯微鏡 用 10 μmol/L Hoechst 33258孵育各組格列吡嗪培養(yǎng)基MIN6細(xì)胞1 h后，熒光顯微鏡下結(jié)果顯示與正常組相比，作用48 h下細(xì)胞內(nèi)的熒光明顯增強(qiáng)，而格列奇特培養(yǎng)基MIN6細(xì)胞1 h后，熒光顯微鏡下結(jié)果顯示與正常組相比，作用48 h下細(xì)胞內(nèi)的熒光無明顯增加，見圖4。

圖4 熒光顯微鏡下Hoechst 33258染色MIN6熒光×200

2.3.2 流式細(xì)胞儀

2.3.2.1 格列吡嗪藥物濃度對MIN6凋亡的影響48 h正常MIN6細(xì)胞內(nèi)Annexin-V的凋亡率為2.4±0.021，格列吡嗪藥物濃度分別為 1 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L培養(yǎng)基培養(yǎng)MIN6細(xì)胞凋亡率分別為 14.74 ±0.501、21.95 ±1.25、42.6 ±5.85。結(jié)果顯示:與正常對照組比較差異顯著，且隨著濃度的增加藥物，作用下的細(xì)胞內(nèi)凋亡率生成明顯增加(F=157.50，P ＜0.01)，見圖5。

2.3.2.2 格列吡嗪藥物刺激下作用時(shí)間對MIN6凋亡率產(chǎn)生的影響 正常MIN6 24 h、48 h、72 h凋亡率分別為 2.18 ±0.8、1.4 ±0.58、3.0 ±0.95，含格列吡嗪10 μmol/L藥物的DMEM培養(yǎng)相同時(shí)間后，凋亡率分別為 10.2 ± 1.54、20.35 ± 1.69、46.9 ±2.89，結(jié)果顯示:與正常對照組比較差異顯著。且在一定范圍內(nèi)隨著時(shí)間的延長，格列吡嗪作用下的細(xì)胞內(nèi)凋亡率生成明顯增多(F=25.42，P ＜0.01)，見圖6。

2.3.2.3 格列奇特對MIN6細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響48 h正常MIN6細(xì)胞內(nèi)正常凋亡率為4.9±0.021，格列奇特藥物濃度分別為 1 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L培養(yǎng)基培養(yǎng)MIN6細(xì)胞凋亡率分別為10.2±1.21、10.47 ±1.05、14.75 ±2.08，與正常對照組無顯著意義(F=2.25，P ＞0.05)，見圖 7。

圖5 不同濃度格列吡嗪培養(yǎng)的細(xì)胞凋亡率

圖6 格列吡嗪不同時(shí)間干預(yù)細(xì)胞凋亡率

3 討論

實(shí)驗(yàn)顯示，格列吡嗪在治療濃度范圍刺激β細(xì)胞，細(xì)胞活力受到抑制，且與藥物的濃度和藥物作用時(shí)間呈依賴關(guān)系，濃度越高，作用時(shí)間越長，細(xì)胞活力抑制越明顯。說明格列吡嗪在治療濃度范圍內(nèi)可誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞的氧化應(yīng)激，產(chǎn)生 ROS，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

圖7 不同濃度格列吡嗪及格列奇特干預(yù)細(xì)胞凋亡率

格列奇特刺激MIN6細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組與對照組無明顯差異。說明格列奇特不能誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞氧化應(yīng)激，不產(chǎn)生ROS，不影響細(xì)胞凋亡。格列奇特是第二代磺脲類降糖藥，研究表明［5－7］，它擁有一個(gè)特異氮雜環(huán)，在體內(nèi)具有廣泛的自由基清除劑的作用，抑制低密度脂蛋白的氧化，降低血小板的活性，減少自由基的產(chǎn)量。能全面增加血漿抗氧化能力，是有用的水溶性抗氧化劑，服用格列奇特10個(gè)月2型糖尿病患者能明顯改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，而服用格列吡嗪、格列本脲的2型糖尿病患者沒有這種作用。最近學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［8－9］，治療濃度的格列奇特能夠直接地保護(hù)因間接性高血糖誘發(fā)的人胰島β細(xì)胞凋亡。它還可以部分抑制因過氧化氫誘導(dǎo)的MIN6死亡。格列奇特孵育的細(xì)胞硝基氨酸產(chǎn)量減少，而線粒體的形態(tài)學(xué)得到改善。而格列本脲沒有這種作用，雖然格列奇特和格列本脲孵育的細(xì)胞胰島素的分泌相似。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也符合以上結(jié)論，說明格列奇特具有抗氧化作用。

糖尿病是一種氧化應(yīng)激增加的狀態(tài)，許多證據(jù)表明氧化性損傷在糖尿病血管微血管并發(fā)癥發(fā)展中起到重要作用。K Tetsushi［10］建立氧誘導(dǎo)的缺血性視網(wǎng)膜病變的糖尿病動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)格列奇特通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來抑制視網(wǎng)膜新生血管形成，從而防止糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。M Monami［11］回顧性觀察了在568名2型糖尿病的門診病人中抽取378名連續(xù)用格列本脲治療，190名患者連續(xù)用格列奇特治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)格列本脲治療組心血管疾病病死率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于格列奇特治療組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示格列奇特不誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激產(chǎn)生ROS，不引起MIN6凋亡，可以部分地解釋以上現(xiàn)象。UKPDS［12］研究248名2型糖尿病患者隨機(jī)口服格列本脲、格列吡嗪、格列奇特5年，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物繼發(fā)性失效率分別是格列奇特7%，格列本脲17.9%(P＜0.1)，格列吡嗪 25.6%(P ＜0.005)，說明了不同磺脲類藥物繼發(fā)性失效率是不同的，其他的一些臨床實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了氯磺丙脲比格列本脲有較高的失效率，格列奇特比格列本脲和格列吡嗪有明顯的低的失效率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說明部分的磺脲類藥物誘發(fā)胰島β細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激產(chǎn)生活性氧，損害β細(xì)胞功能，激活細(xì)胞.凋亡途徑，引起細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致β細(xì)胞耗竭。而格列奇特對β細(xì)胞不直接產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。臨床上磺脲類藥物出現(xiàn)繼發(fā)性失效現(xiàn)象與藥物刺激β細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激可能有一定的關(guān)系，還需要進(jìn)一步的探討。

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