劉洪博 張清泉 杜紅麗 侯素平 李 聰

子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌。研究認為，在一些發(fā)展中國家和地區(qū)子宮頸癌5年生存率為20%～40%[1]。在對中晚期子宮頸癌患者化療中，鉑類藥物不論是在單藥還是聯(lián)合治療方面，應用均相當廣泛且均具有絕對優(yōu)勢[2]。癌細胞產生抗藥性和腎臟毒性是導致子宮頸癌患者治療失敗的主要原因之一，而人類銅轉運蛋白 1（human copper transporter 1,hCTR1）可調節(jié)腫瘤細胞中順鉑（cisplatin,cDDP）的含量。本研究旨在應用組織芯片技術探討hCTR1在子宮頸鱗癌中的表達情況及輔助治療作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年6月—2011年5月于河北省人民醫(yī)院和哈勵遜國際和平醫(yī)院婦科門診活檢、錐切或住院手術患者的子宮頸組織標本共189例，患者年齡27～59歲，中位年齡46.7歲。子宮頸鱗狀細胞癌組52例，其中子宮頸鱗癌原發(fā)組40例，除3例術前進行放療外，其余術前均未進行放化療；復發(fā)組12例，第2次手術前均進行了3～8個療程的放化療。宮頸上皮內瘤樣病變（CIN）106例，其中CINⅠ組34例，CINⅡ～Ⅲ組72例。正常宮頸組31例，取自同期子宮良性病變行子宮切除術的宮頸。各組標本均由2位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師對所有切片進行復查。同時收集患者臨床病理資料包括腫瘤大小、組織學分級按照《外科病理學》第2版的標準、臨床分期參照2008年FIGURE O/IGCS婦科惡性腫瘤分期及臨床實踐指南、淋巴結轉移情況等。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片的制作 根據(jù)實驗需要，共設計為8×8點陣組織芯片3張。自制組織取樣器和受體蠟模 ，制備取樣與組織蠟芯后進行切片及裱片，完成組織芯片制作，見圖1。

1.2.2 免疫組織化學染色（IHC） hCTR1兔抗多克隆抗體購自英國NOVUS生物技術公司；即用型SP通用試劑盒 （SP-9001）和DAB顯色劑均購自北京中杉生物技術公司。應用SP法進行免疫組織化學染色，其中3張切片作hCTR1免疫組化染色，均設立陽性對照和陰性對照，用預實驗中已知的陽性組織切片作為陽性對照；用0.1 mol/L PBS代替一抗，作為陰性對照。

1.3 結果判定 （1）組織芯片染色結果判定。組織芯片中研究樣本充足的位點為有效患者；因供體組織太少或缺失，判斷為無效或無意義患者，該患者在研究樣本中剔除。（2）免疫組織化學結果判定。參照文獻[3]，hCTR1定位于細胞質或（和）細胞膜，對組織芯片上每個位點的免疫組化染色進行評價，隨機觀察5個高倍視野（×200）下綜合染色強度和陽性細胞所占比例進行半定量測定。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 組織芯片及HE染色質量評價 制備完成的組織芯片蠟塊完整，切片組織點陣排列整齊，定位明確；組織芯片各有意義位點的病變組織結構完整，見圖2。正常宮頸組31例中鏡下有意義組織23例；CINⅠ組34例中有意義者27例；CINⅡ～Ⅲ 組72例，有意義者67例；子宮頸鱗癌組52例，均為有意義組織。

2.2 免疫組織化學染色結果 31例正常宮頸鱗狀上皮hCTR1表達較低，僅在基底層一些細胞中表達，見圖3。CIN組及子宮頸癌組患者hCTR1陽性表達顯著增加，見圖4～6。CINⅡ～Ⅲ組較正常宮頸組及CINⅠ組中hCTR1的陽性表達增加 （P<0.01），宮頸鱗癌組較正常宮頸組及CINⅠ組中hCTR1表達增加（P<0.01），但CINⅠ組與正常宮頸組，CINⅡ～Ⅲ組與宮頸鱗癌組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

Table 1 The protein expression of hCTR1 in various lesions of cervical squamous epithelium表1 不同級別宮頸組織中hCTR1蛋白的表達 例（%）

2.3 hCTR1蛋白表達與子宮頸鱗癌患者臨床病理特征的關系 hCTR1蛋白的表達在不同年齡、臨床分期、腫瘤大小、病理分級及有無淋巴結轉移子宮頸鱗癌患者間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

2.4 hCTR1原發(fā)子宮頸鱗癌和復發(fā)子宮頸鱗癌中的表達情況 hCTR1在子宮頸原位癌的陽性率高于子宮頸早期浸潤癌；hCTR1蛋白在原發(fā)子宮頸鱗癌和復發(fā)子宮頸鱗癌中表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表3。術后1年隨訪，原發(fā)組宮頸癌患者共39例，1例轉院，其中臨床分期Ⅰb期患者2例，術后僅進行了放療，其余37例患者術后進行放、化療，通過對hCTR1蛋白的檢測，化療采取博來霉素+順鉑方案（PF），患者情況良好，無局部復發(fā)。另12例復發(fā)癌患者，通過對hCTR1的檢測，婦科臨床調整了cDDP使用劑量，情況良好，目前無二次復發(fā)。

Table 3 The protein expression of hCTR1 in primary cervical squamous carcinoma,recurrent cervical squamous carcinoma and early invasive carcinoma表3 hCTR1蛋白在原發(fā)子宮頸鱗癌、復發(fā)子宮頸鱗癌和早期浸潤癌中表達 例（%）

3 討論

3.1 hCTR1負責轉運抗腫瘤的鉑類化合物 目前比較認同子宮頸癌化療最有效的藥物是鉑類藥物，cDDP是比較常用的化療藥物，以cDDP為基礎的聯(lián)合化療的有效率可達80%以上[4]。hCTR1蛋白被認為是人體內具有高親和力的銅攝入蛋白，可調節(jié)腫瘤細胞中cDDP的含量。該基因位于染色體9q31/32上，編碼蛋白存在于真核生物細胞膜和細胞質中高爾基體上[5]。Holzer等[6]研究顯示，細胞膜上主要負責銅進入的載體——CTR1，也是負責cDDP進入酵母體和哺乳動物細胞的不可缺少的部分。近來研究發(fā)現(xiàn)，很多類型的腫瘤患者血清中含有異常高水平的銅；且銅與化療藥物cDDP關系密切，并且認為銅可能影響化療效果[7-8]。銅轉運蛋白家族不僅參與銅離子的代謝,也參與鉑類抗腫瘤藥物入胞和出胞的調節(jié)[5]，銅和cDDP是相反的的兩極，但它們的吸收受相似的細胞外因子影響，如K+離子的濃度和pH值等。Holzer等[6]將人類卵巢惡性腫瘤細胞暴露于2μmol/L的 cDDP中15 min，結果顯示腫瘤細胞上的hCTR1完全消失，認為cDDP引起hCTR1丟失，可能與細胞膜和細胞間橋的重新分布有關，但當移去cDDP 30 min后，腫瘤細胞的hCTR1蛋白水平又恢復正常，表明hCTR1的合成是快速的。Petris等[9]研究認為，利用化學抑制劑β-甲基環(huán)糊精可阻止cDDP誘導的哺乳動物的hCTR1丟失。于海林等[10]通過構建重組反轉錄病毒載體pBABEpuro-hCTRI，轉染包裝細胞后感染人卵巢癌細胞株SKOV-3，結果顯示hCTR1參與卵巢癌細胞對cDDP的轉運，其高表達可增強SKOV-3細胞對cDDP攝入能力和敏感性。

3.2 hCTR1蛋白的表達與子宮頸鱗癌患者臨床病理關系 Holzer等[11]報道hCTR1在多種組織中表達，尤其在胰腺的α細胞、胃黏膜及細支氣管黏膜的內分泌細胞、甲狀腺的C細胞等。但hCTR1在正常子宮頸組織、CIN及子宮頸鱗癌組織中的表達情況尚少見報道。本研究結果顯示，hCTR1在子宮頸原位癌中的陽性要高于子宮頸早期浸潤癌，提示hCTR1與惡性腫瘤生物學特征侵襲性可能存在負相關性，其確切的生物學功能尚需要進一步研究證實。研究認為，細胞中hCTR1的合成與谷胱甘肽（L-Glutathione,GSH）和 β-甲基環(huán)糊精含量有關，增加GSH含量可提高的腫瘤細胞對cDDP的敏感性[7-8]。因此，腫瘤患者在化療期間可以給予GSH或β-甲基環(huán)糊精進行人為干預，減少腫瘤細胞中hCTR1蛋白的流失，促進其合成，提高腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性，從而降低腫瘤患者的病死率。本研究術后一年的隨訪及相應治療方案證實了hCTR1蛋白在放化療中的輔助應用。綜上所述，通過檢測hCTR1蛋白表達，從而對這些轉運體活性進行調節(jié)，可提高腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性，輔助建立鉑類抗癌藥物耐藥的警示系統(tǒng)。

[1]張友忠,姜潔,張貴宇,等.第12屆國際婦科癌癥學會會議紀要[J].現(xiàn)代婦產科進展,2009,18(1):1-6.

[2]孟麗燕，石娟，周紅林.子宮頸癌治療新進展[J].醫(yī)學綜述，2009,15（20）：3089-3091.

[3]王暉，羅春芳，蘆玉蘭，等.應用組織芯片技術研究MMP-9和PCNA在宮頸癌組織中的表達及其意義[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2010,19（5）：457-462.

[4]梁躍，葉青山.子宮頸癌的化療現(xiàn)狀 [J].中國醫(yī)藥導報，2009,6（23）：7-9.

[5]Maryon EB,Zhang J,Jellison JW,etal.Human copper transporter 1 lacking O-linked glycosylation is proteolytically cleaved in a Rab9-positive endosomal compartment[J].J Biol Chem,2009,284(41):28104-28114.

[6]Holzer AK,Howell SB.The internalization and degradation of human copper transporter 1 following cisplatin exposure[J].Cancer Res,2006,66(22):10944-10952.

[7]Kuo MT,Chen HH,Song IS,etal.The roles of copper transporters in cisplatin resistance[J].Cancer Metastasis Rev,2007,26(1):71-83.

[8]Wu Z,Liu Q,Liang X,etal.Reactivity of platinum-based antitumor drugs towards a Met-and His-rich 20mer peptide corresponding to the N-terminal domain of human copper transporter 1[J].J Biol Inorg Chem,2009,14(8):1313-1323.

[9]Petris MJ,Smith K,Lee J,etal.Copperstimulated endocytosis and degradation of the human copper transporter,hCTR1[J].J Biol Chem,2003,278（11）:9639-9646.

[10]于海林，姜燕，趙亮，等.卵巢癌細胞中hCTR1的表達與細胞對順鉑耐藥的相關研究[J].腫瘤,2009,10(29):934-939.

[11]Holzer AK,Varki NM,Le QT,etal.Expression of the human copper influx transporter 1 in Normal and malignant human tissues[J].JHistochem Cytochem，2006,54(9):1041-1049.