陳紅漫 趙振苓 袁 莉 郭景霞 齊美霞

據(jù)統(tǒng)計(jì)2011年美國有46 470例新發(fā)子宮內(nèi)膜癌（EC），其中 8 120例最終死亡[1]。楊丹等[2]研究認(rèn)為，我國目前EC發(fā)病率及致死率呈逐年增長趨勢。但目前有關(guān)EC發(fā)病機(jī)制的研究尚不明確，臨床較為認(rèn)同的觀點(diǎn)是“無抵抗雌激素”學(xué)說。有研究表明，胰島素樣生長因子（IGF）-1通過刺激雌激素的表達(dá)促使無孕激素拮抗的雌激素增多，從而誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜向惡性轉(zhuǎn)變[3]。環(huán)氧合酶（COX）-2則通過促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促使子宮內(nèi)膜癌變[4]。但目前有關(guān)IGF-1、COX-2與EC表達(dá)的相關(guān)性及其與臨床病理特征的關(guān)系尚未明了。本研究旨在探討IGF-1及COX-2在EC發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期為臨床診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取1996年1月—2010年12月于天津市第五中心醫(yī)院婦科就診的150例子宮內(nèi)膜樣腺癌患者（EA組），全部患者臨床資料完整，活檢前均未接受放療、化療及生物治療，年齡 31～80歲，平均（59.2±11.0）歲。根據(jù) 2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟FIGO標(biāo)準(zhǔn)，病理Ⅰ期98例，Ⅱ期20例，Ⅲ期和Ⅳ期32例。組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)（高分化，G1）82例，Ⅱ級(jí)（中分化，G2）38 例，Ⅲ級(jí)（低分化，G3）30 例。同期選取子宮內(nèi)膜非典型增生患者 （AHE）組54例，年齡32～75歲，平均（56.2±10.6）歲。選取因良性疾患行子宮全切的正常子宮內(nèi)膜（NE 組）患者 84 例，年齡 28～68 歲，平均（53.2±10.9）歲。獲取3組的子宮內(nèi)膜樣本，所有標(biāo)本均經(jīng)2位病理醫(yī)師分別診斷復(fù)查核實(shí)。

1.2 主要儀器與試劑 濃縮型兔抗人IGF-1多克隆抗體（產(chǎn)品編號(hào)：ab9572）、濃縮型兔抗人COX-2多克隆抗體（產(chǎn)品編號(hào)：ab15191）購自美國abcam公司，工作濃度分別為1∶200和1∶100。通用型SP染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉試劑公司。組織芯片打孔儀（美國Beecher公司）。

1.3 方法 （1）組織芯片制備。取樣前對(duì)蠟塊的HE切片做鏡下形態(tài)學(xué)觀察，圈出各組患者標(biāo)本包含有EC及正常內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)的位置，并在蠟塊確定取樣部位，使用組織芯片打孔儀在每個(gè)蠟塊穿取組織芯片。（2）免疫組化方法。將各組組織芯片蠟塊以3μm連續(xù)切片，選出組織樣本完整的切片先做常規(guī)HE染色，再應(yīng)用SP法對(duì)其進(jìn)行IGF-1和COX-2抗體染色，抗體孵育前均經(jīng)熱修復(fù)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。以芯片內(nèi)不同類型組織作內(nèi)對(duì)照，以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。IGF-1以乳腺癌組織為陽性對(duì)照、COX-2以結(jié)腸癌組織為陽性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷 采用SP免疫組化法檢測，3組內(nèi)均設(shè)陰性及陽性對(duì)照。陽性信號(hào)為細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色細(xì)小顆粒。COX-2陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞漿（膜），IGF-1陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞漿。高倍鏡下（×400）隨機(jī)取5個(gè)不同的視野，各計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，以每高倍鏡下陽性細(xì)胞數(shù)量及染色強(qiáng)度分別對(duì)IGF-1和COX-2的細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞膜進(jìn)行陽性判斷，標(biāo)準(zhǔn)如下：根據(jù)陽性細(xì)胞染色深淺及陽性細(xì)胞比例打分，細(xì)胞無色為0分，淡黃色1分，深黃色2分，棕褐色3分；陽性細(xì)胞比例<25%為0分，25%～50%為1分，51～75%為2分，>75%為3分。根據(jù)二者乘積綜合評(píng)分，累計(jì)積分0分為陰性，1分以上為陽性。結(jié)果判斷均由2名病理醫(yī)師雙盲法判定并統(tǒng)一核準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。計(jì)數(shù)資料比較用卡方（χ2）檢驗(yàn)，IGF-1和COX-2的相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Figure 1 The expression of IGF-1 in different endometrium groups（SP×400）圖1 IGF-1在各組中的表達(dá)情況（SP×400）

Figure 2 The expression of COX-2 in different endometrium groups（SP×400）圖2 COX-2在各組中的表達(dá)情況（SP×400）

2 結(jié)果

2.1 各組 IGF-1及COX-2病理表達(dá)結(jié)果 NE組、AHE組及EA組的IGF-1和COX-2均分別呈陰性、弱陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖1、2。

2.2 各組IGF-1和COX-2基因的表達(dá) NE、AHE及EA組IGF-1和COX-2陽性表達(dá)構(gòu)成差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。其中，NE組與AHE組IGF-1和COX-2陽性表達(dá)構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），EA組 IGF-1陽性表達(dá)構(gòu)成高于 NE組和AHE組 （P<0.05或 P<0.01），EA 組 COX-2陽性表達(dá)構(gòu)成高于NE組（P<0.01），見表1。

2.2 IGF-1及COX-2基因表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 EA組IGF-1陽性表達(dá)率在不同子宮肌層浸潤間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而在不同病理分級(jí)、手術(shù)分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。COX-2陽性表達(dá)率在不同病理分級(jí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而在不同子宮肌層浸潤深度、手術(shù)分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

Table 1 Comparison of IGF-1 and COX-2 expressions between different endometrial tissues表1 各組IGF-1及COX-2蛋白表達(dá)的比較例（%）

Table 2 Correlation between the expression of IGF-1 or COX-2 and clinicopathological characteristics in EA group表2 EA組IGF-1及COX-2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

2.3 IGF-1和COX-2在EA組織中表達(dá)的相關(guān)分析 IGF-1和COX-2的表達(dá)呈正相關(guān) （P<0.05），見表3。

Table 3 Correlation between IGF-1 and COX-2 expressions in EA tissues表3 IGF-1和COX-2在EA中表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

IGF-1的結(jié)構(gòu)與胰島素相似，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和抗細(xì)胞凋亡的作用，它通過自分泌與旁分泌機(jī)制促進(jìn)組織細(xì)胞增殖、抑制其凋亡，并調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。IGF-1是一種細(xì)胞增殖調(diào)控因子，能夠加速氨基酸及葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，從而增加蛋白質(zhì)的合成，減少蛋白質(zhì)的降解，向細(xì)胞內(nèi)傳遞信息產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。IGF-1對(duì)惡性細(xì)胞具有較強(qiáng)的有絲分裂原性和抗凋亡活性，其在刺激細(xì)胞增殖的同時(shí)，還可切斷細(xì)胞凋亡的途徑。另外，IGF-1與其受體結(jié)合啟動(dòng)磷脂酰肌醇3激酶 （PI3K）/Akt信號(hào)途徑和絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號(hào)途徑，可分別抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖[5]。COX-2是前列腺素（PGs）合成過程中的一個(gè)重要限速酶，可催化花生四烯酸產(chǎn)生各種PGs產(chǎn)物，此外其還有誘導(dǎo)蛋白表達(dá)功能。COX-2在正常組織的表達(dá)量很低，卻能很快被炎癥因子激活誘導(dǎo)，并經(jīng)常在人類腫瘤組織中高表達(dá)，還可能在絲裂原誘導(dǎo)下導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展。近年來，研究已證實(shí)COX-2可通過直接或間接的方式促進(jìn)雌激素的表達(dá)，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[6]。但目前有關(guān)IGF-1和COX-2促進(jìn)EC表達(dá)的分子機(jī)制還不十分清楚。

子宮內(nèi)膜樣腺癌（EA）屬于雌激素依賴型（Ⅰ型）的高分化EC，占全部EC的85%以上，由子宮內(nèi)膜不典型增生癥發(fā)展而來。多項(xiàng)研究表明，IGF-1和COX-2在多種腫瘤中呈高表達(dá)，共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-11]。Henriksen等[7]研究顯示，IGF-1和COX-2在乳腺癌中高表達(dá)且均與腫瘤臨床分期和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，IGF-1及COX-2在NE組較少表達(dá)，而在AHE尤其是EA中有較高水平表達(dá)，與上述報(bào)道相近。Bustin等[8]研究顯示IGF-1和 COX-2在結(jié)腸癌中高表達(dá),且IGF-1的高表達(dá)同COX-2的mRNA水平相關(guān)。目前，COX-2抑制劑對(duì)結(jié)腸癌的預(yù)防和治療已在臨床應(yīng)用取得較好效果。本研究顯示在EA組織中子宮肌層浸潤深度≥1/2者的IGF-1陽性表達(dá)比例高于無肌層浸潤或浸潤<1/2者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。COX-2在不同病理分級(jí)中的表達(dá)有差異，分化越差的內(nèi)膜癌組織中COX-2表達(dá)陽性率越低，提示COX-2可能作為判斷EA分化的標(biāo)志，但COX-2在分化差的EA組織中表達(dá)下調(diào)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究顯示，雖然AHE組的IGF-1及COX-2陽性表達(dá)率與NE組無差異，但AHE的數(shù)值均高于NE組，表明AHE可能更易發(fā)生癌變。因此，對(duì)于IGF-1及COX-2呈陽性表達(dá)的AHE者，更應(yīng)加強(qiáng)隨訪，制定合理的治療方案。目前，有關(guān)IGF-1和 COX-2在EA表達(dá)的相關(guān)性研究尚少見報(bào)道。本研究顯示IGF-1和COX-2在EA中的表達(dá)成正相關(guān)，這與二者在前列腺癌[9]、乳腺癌[10]和卵巢癌[11]中的相關(guān)性報(bào)道一致，表明二者在性腺相關(guān)腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了一定的作用，可能是一種激素依賴性的腫瘤分子標(biāo)志物，提示其在EA發(fā)生發(fā)展中可能存在著較密切的協(xié)同作用。Cao等[11]報(bào)道IGF-1誘導(dǎo)COX-2的過表達(dá)在卵巢癌的發(fā)展及預(yù)后中起重要作用，是通過PI3K、MAPK和PKC 3種信號(hào)轉(zhuǎn)錄途徑分別調(diào)節(jié)COX-2在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)來完成的；該研究認(rèn)為，COX-2在卵巢癌中過表達(dá)同浸潤表型和不良臨床預(yù)后相關(guān)。目前研究認(rèn)為，COX-2的致癌機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡失調(diào)，以及抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫等[12]。Mitsutoshi等[13]報(bào)道雌激素可通過雌激素受體上調(diào)人類子宮微血管內(nèi)皮細(xì)胞系的COX-2表達(dá)，其表達(dá)調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平。

綜上所述，聯(lián)合檢測IGF-1及COX-2表達(dá)有助于早期診斷子宮內(nèi)膜癌及其癌前病變，有助于綜合評(píng)估EA的生物學(xué)行為，并可作為預(yù)測EA分化浸潤的生物學(xué)指標(biāo)。但關(guān)于IGF-1在不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中作為COX-2的上游基因促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，以及激活調(diào)控COX-2基因在EC的高表達(dá)還有待進(jìn)一步深入研究。

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