付蘇雷 楊慈清 賈陽陽 李 晗 郭志坤 林俊堂

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學技術學院，新鄉(xiāng)453003)

高等動物的大腦皮層是一個高度組織、由多層神經(jīng)細胞構成的復合體，神經(jīng)發(fā)生始于胚胎期的室管膜區(qū)和室管膜下區(qū)，此處的神經(jīng)干細胞增殖分化為神經(jīng)前體細胞，再向外遷移逐步分化和成熟形成皮層板的各層神經(jīng)元細胞。這種遷移是一個神經(jīng)元由內(nèi)至外的裝配過程，即inside-out的過程［1］，這個發(fā)育過程受到嚴格的調(diào)控以確保建立正確的、有功能的大腦皮層。一旦皮層發(fā)育異常，特別是神經(jīng)元遷移異常，就會對大腦功能產(chǎn)生影響，造成諸如精神分裂癥、癲癇、自閉癥等多種疾病。

神經(jīng)鈣黏蛋白(Neural cadherin，N-Cadherin)最先在雞胚胎神經(jīng)管中被發(fā)現(xiàn)，是鈣黏連蛋白家族中第一個在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的成員。有研究表明，N-Cadherin介導了細胞間黏附及信號轉導，具有識別細胞、調(diào)控組織器官形態(tài)發(fā)生等生物學功能。Tan等［2］發(fā)現(xiàn)神經(jīng)電活動依賴的樹突形態(tài)發(fā)生需要NCadherin介導的神經(jīng)元之間的相互作用，并且NCadherin依賴的神經(jīng)元之間的相互接觸在新生樹突維持過程中具有特異作用。Masakazu等［3］通過條件性基因敲除小鼠證明N-Cadherin沉默后的小鼠大腦皮層沒有明顯的層狀結構，出現(xiàn)分層混亂的現(xiàn)象。本實驗利用小鼠活體子宮內(nèi)電轉基因(In utero electroporation，IUE)技術，將雞源性的 N-Cadherin轉染到E15胎鼠的大腦皮層，實現(xiàn)異源性N-Cadherin的超表達，結合RNA干擾技術實現(xiàn)N-Cadherin的抑制表達，用GFP作為示蹤，采用熒光免疫組化綜合分析N-Cadherin異常表達對小鼠胚胎發(fā)育過程大腦皮層神經(jīng)元遷移的影響，為研究N-Cadherin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 本實驗所用小鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學院動物中心提供;雞源pCAGGS-N-Cadherin真核表達質(zhì)粒和pCAGGS-GFP(綠色熒光蛋白)質(zhì)粒由Redies教授饋贈，shRNA干擾載體pGPU/GFP/Neomouse-N-Cadherin-shRNA由百奇生物科技有限公司合成構建，DAPI購自羅氏公司，Rabbit anti N-Cadherin抗體(識別雞源組織)由Redies教授饋贈;二抗為Goat anti Rabbit Cy3標記(Molecular Probes);CUY-21型多功能活體電轉化儀(日本 NEPA公司);M205FA型倒置體視熒光顯微鏡(德國 Leica公司);Nikon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡(日本);CM1850型冷凍切片機(德國Leica公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 同源性比較 從Genbank數(shù)據(jù)庫中查到小鼠 N-Cadherin(NCBI No.NM_007664.4)的 CDS序列有2 721 bp，其對應的氨基酸為906個;雞N-Cadherin(NCBI No.NM_001001615.1)的 CDS序列有2 739 bp，其對應的氨基酸為912個，且與本實驗所用真核表達質(zhì)粒pCAGGS-N-Cadherin中N-Cadherin序列一致。利用DNAman7.0生物軟件比較兩物種N-Cadherin的CDS序列和氨基端序列同源性。

1.2.2 小鼠子宮內(nèi)電轉 將健康成年小鼠雌雄各1只于第一天晚上7點合籠，第二天早上7點檢查雌鼠是否有陰道栓，有陰道栓記為懷孕0.5天(胎鼠E0.5)，第三天 7點記為懷孕 1.5天(胎鼠E1.5)，以此類推。取懷孕15天的小鼠進行實驗，將孕鼠用4.3%的水合氯醛按照0.01 ml/g體重腹腔注射，注射時避免扎到胚胎;約5分鐘后小鼠被麻醉，剔除腹部中線附近被毛，然后腹部朝上固定于超凈工作臺內(nèi)37℃加熱墊的手術墊單上，用75%的酒精棉球和碘酒給孕鼠腹部徹底消毒，用無菌的手術器械沿腹中線剪開一個大約2～3 cm長的小口，取出兩側子宮，并不斷在子宮上滴加37℃已加抗生素的生理鹽水，保持子宮濕潤;用顯微注射毛細玻璃針吸取準備好的質(zhì)粒0.5～1 μl準確注射到胎鼠側腦室，再把電轉儀板狀電極的正負兩極分別放在胎鼠的左右腦，正極在擬轉基因一側;使用電轉儀進行電擊，電轉電壓35 V，每次電擊時間60 ms，間隔時間600 ms，電脈沖數(shù)5次，從子宮頸口胚胎向兩側計數(shù)，記錄轉染胚胎位置，每側子宮轉染1～2個胚胎，轉染完成后把子宮放回腹腔，將創(chuàng)口縫合并放在37℃加熱墊上，手術2～3小時后小鼠恢復清醒。小鼠存活5天后，將其處死，根據(jù)記錄位置，取出轉染胚胎，在體視熒光顯微鏡下觀察結果，電轉部位呈現(xiàn)綠色熒光者(GFP顏色)視為陽性。

1.2.3 取材及切片 取體視熒光顯微鏡下觀察為陽性表達的胚胎，在普通體視顯微鏡下，采用尖頭鑷子小心去除皮膚和腦骨膜，用腦小鏟從腦干向嗅球的方向完整取出整個腦組織，轉移至4℃預冷處理的PBS液漂洗2～3次，浸沒于裝有4%PFA(多聚甲醛)的EP管中，置保溫盒冰塊中搖床搖晃過夜，次日取出組織，吸干液體，轉移到18%蔗糖溶液置冰盒中搖晃過夜，待組織沉淀到管底時取出組織吸干液體，根據(jù)組織大小，用錫箔紙做好模型，用OCT包埋，注意方向，嗅球朝上腦干朝下，確定好位置，置于液氮中冷凍后放－80℃冰箱保存，切片時取出已包埋的組織，在冰凍切片機上冠狀連續(xù)切片，厚度20 μm，切片后置烤片機上，37℃烤片30分鐘以上，放－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 熒光免疫組織化學染色 從－80℃冰箱中取出冰凍切片40℃干燥20分鐘，4%PFA中4℃固定15分鐘，用1×TBS清洗3次，每次5分鐘，在含0.1%Triton X-100的1×TBS中再孵育5分鐘。每張載玻片上加1 ml免疫組化封閉液，濕盒中孵育1小時。去除封閉液后每張載玻片加300 μl用封閉液稀釋的合適濃度Rabbit anti N-Cadherin(1∶500)一抗，4℃孵育過夜后，1×TBS清洗3次，每次5分鐘，然后每張片加300 μl用封閉液稀釋的Cy3標記的Goat anti Rabbit二抗，室溫孵育1小時后，用1×TBS清洗3次，每次5分鐘。最后滴加DAPI封片劑染色10分鐘，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 圖像處理分析 用Photoshop CS3軟件處理圖片，可將2種染色同位疊加在一起，從而分析蛋白質(zhì)的表達定位。

2 結果

2.1 雞源與鼠源N-cadherin同源性比較結果 借助DNAman7.0生物軟件對兩物種 N-Cadherin的CDS序列和各自編碼氨基端序列進行同源性比較，同源相似性分別為77.25%和85.42%，說明二者為來自不同物種的同源基因。

2.2 雞源性N-cadherin超表達對小鼠大腦皮層發(fā)育過程神經(jīng)元遷移的影響 從圖(1A-C)中可以看出，在胚胎發(fā)育的E15時轉染pCAGGS-GFP后，E20時取材切片，被轉染GFP陽性表達的神經(jīng)元從內(nèi)向外遷移，大多數(shù)已遷移到皮層Ⅱ-Ⅳ層(圖1B)，同時在Ⅴ-Ⅵ層也有部分神經(jīng)元，在亞室管膜(Subventrical zone，SVZ)也存在大量GFP陽性表達的細胞。將雞源性pCAGGS-N-Cadherin表達載體與pCAGGSGFP共轉染后，從圖(1D-F)中可以看到，雞源性NCadherin在小鼠大腦皮層中能夠實現(xiàn)超表達(圖1D)，實驗中Rabbit anti N-Cadherin單克隆抗體不能夠與鼠N-Cadherin結合，圖(1D)中紅色標記的即為雞源性N-Cadherin超表達結果，N-Cadherin實現(xiàn)超表達后E20時(圖1D-F)可以看出大多數(shù)神經(jīng)元已經(jīng)遷移到Ⅱ-Ⅳ層，與對照組相比，GFP標記的神經(jīng)元在Ⅴ-Ⅵ層和SVZ區(qū)的數(shù)量較少。

圖1 活體子宮內(nèi)對胎鼠大腦皮層電轉N-Cadherin及其shRNAFig.1 N-Cadherin and its shRNA transfection into mouse embryonic cerebral cortex with in utero electroporation

2.3 N-cadherin抑制表達對小鼠大腦皮層發(fā)育過程神經(jīng)元遷移的影響 針對小鼠N-Cadherin上的GCCTATGAAGGAACCACATGA靶序列設計shRNA干擾載體(pGPU/GFP/Neo-mouse-N-Cadherin-shRNA)，該載體自身攜帶有GFP報告基因，但在預實驗中我們發(fā)現(xiàn)單獨轉染該載體所表達的GFP熒光非常微弱，很難檢測到綠色熒光，因此我們將能強表達GFP的pCAGGS-GFP質(zhì)粒與其共轉，且shRNA干擾載體與 pCAGGS-GFP質(zhì)粒的濃度比為8∶1，確保pCAGGS-GFP轉染的細胞同時也被shRNA干擾載體轉染。從圖(1G-I)中可以看到，將shRNA干擾載體與pCAGGS-GFP質(zhì)粒共轉染后E20時，大量GFP陽性表達的細胞停留在SVZ區(qū)，很少有細胞遷移到Ⅱ-Ⅳ層，與對照組相比(圖1A-C)存在明顯差別。

3 討論

本研究中利用小鼠子宮內(nèi)電轉基因技術將帶有強啟動子的真核表達載體pCAGGS-N-Cadherin和帶有干擾片段的shRNA干擾載體轉染到胎鼠的室管膜區(qū)，由此實現(xiàn)了對N-Cadherin的超表達和抑制表達。有研究表明對E10.5～E11.5胎鼠用放射性標記物標記室管膜的細胞，被標記的神經(jīng)元最終大部分位于較深的板層中，在E12.5～E13.5標記的細胞，最終位于皮層中間的板層中，在E15.5～E16.5標記的細胞，最終位于皮層的第Ⅱ板層［4，5］。由于是對E15的胎鼠進行電轉，此時的神經(jīng)元應該遷移到皮層的Ⅱ～Ⅳ層，從我們實驗的對照組中也可以看到同樣的結果;與對照組相比，N-Cadherin超表達后促進了神經(jīng)元的遷移，有更多GFP標記的神經(jīng)元遷移到Ⅱ～Ⅳ層;然而N-Cadherin被干擾后阻礙了神經(jīng)元的遷移，被標記神經(jīng)元明顯停滯在室管膜區(qū)。我們把能夠強烈表達GFP的質(zhì)粒與目的質(zhì)粒(濃度比為1∶8)混合共轉染，保證了目的質(zhì)粒轉染的細胞同時也被GFP質(zhì)粒轉染，GFP作為報告基因對觀察神經(jīng)元的遷移狀況很方便，而且GFP的表達對胚胎的發(fā)育不存在影響［6］。在條件性基因敲除小鼠模型中N-Cadherin沉默小鼠大腦皮層出現(xiàn)了混亂狀態(tài)，完全失去了正常的層的結構，而且皮層中有絲分裂細胞的分布也出現(xiàn)異常，可見N-Cadherin在神經(jīng)細胞遷移過程中具有非常重要的作用［3］。但是N-Cadherin不是唯一一個對大腦皮層發(fā)育和神經(jīng)元遷移起作用的分子，潘樂等［7］結合RNA干擾和子宮內(nèi)電轉技術研究發(fā)現(xiàn)DAM17對于小鼠大腦皮層發(fā)育中期神經(jīng)前體細胞向外側遷移是必需的，干擾ADAM17的表達會造成神經(jīng)前體細胞滯留在腦室區(qū)和腦室下區(qū);神經(jīng)元的向外遷移分為膠質(zhì)細胞依賴型和非膠質(zhì)細胞依賴型兩種，研究表明在非膠質(zhì)細胞依賴型的神經(jīng)元遷移中，Reelin調(diào)控Dap1激活Rap1，Rap1調(diào)節(jié)N-Cadherin表達，進而控制神經(jīng)元的遷移和定位［8，9］;Robo4在皮層神經(jīng)元的放射狀遷移中具有重要的作用，上調(diào)皮層中新生神經(jīng)元的Robo4表達導致新生神經(jīng)元的放射狀遷移出現(xiàn)嚴重缺陷［10］;可能還有很多沒有被發(fā)現(xiàn)的分子起著重要的作用，他們共同構成一個調(diào)控網(wǎng)絡來調(diào)控大腦皮層的發(fā)育。RNA干擾結合活體子宮內(nèi)電轉基因方法與基因敲除技術相比具有明顯的優(yōu)點:①局部受到干擾后的胚胎可以繼續(xù)生長發(fā)育便于長時間觀察受干擾細胞的生命活動狀況，而基因敲除小鼠的靶基因整體被沉默，對于胚胎發(fā)育過程中功能必須的基因沉默常常在胚胎發(fā)育過程導致個體的死亡，使持續(xù)觀察受限;②可以通過質(zhì)?；旌瞎厕D染的方法特異性的研究兩個及兩個以上基因的相互作用;③子宮內(nèi)電轉基因技術可以實現(xiàn)基因的定時定位抑制表達，有利于在特定時間特定部位研究基因的功能。但是對于研究E12天以前與胚胎發(fā)育的相關分子，子宮內(nèi)電轉技術也有其缺陷，因為對懷孕不到12天的小鼠進行電轉容易造成小鼠流產(chǎn)，很難獲得成功轉染的胚胎?？傊琋-Cadherin作為一種細胞間同種黏附的鈣依賴型跨膜糖蛋白，主要分布于神經(jīng)和肌肉組織，在神經(jīng)元的遷移定位、突觸的形成、神經(jīng)軸突的導向生長及靶向識別中起重要作用，而且在受到干擾后沒有觀察到明顯的補償機制，因此我們可以選擇N-Cadherin作為關鍵分子，結合子宮內(nèi)電轉基因技術定時定位研究與其相關的上下游分子，進而研究皮層發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡。

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