于 鴻 徐廣偉 魏天雪 陳智嘉

(吉林省腫瘤防治研究所，長(zhǎng)春130012)

樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)的特點(diǎn)是捕獲和提呈抗原的能力高，可遷移到淋巴器官，并表達(dá)抗原特異性淋巴細(xì)胞活化所需的各種共刺激分子。近年來(lái)隨著對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞及其抗腫瘤作用的深入研究，新的功能靶分子和新技術(shù)手段為其臨床應(yīng)用提供了更廣闊的前景。已經(jīng)證明細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子1(Suppressor of cytokine signaling，SOCS1)在調(diào)控樹(shù)突狀細(xì)胞的功能，抑制炎癥性疾病和系統(tǒng)性自身免疫中發(fā)揮重要的作用。SOCS1作為一個(gè)各種細(xì)胞因子如 IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12 或 IL-15 負(fù)調(diào)控的信號(hào)，通過(guò)抑制Janus激酶(JAKs)在T細(xì)胞和其他的免疫細(xì)胞中發(fā)揮作用［1］。SOCS1基因沉默導(dǎo)致DCs的IL-12信號(hào)和下游細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)不受約束，從而導(dǎo)致宿主水平自身耐受的打破和自身免疫性 病 理 反 應(yīng)［2］。RNA 干 擾 (RNA interference，RNAi)是對(duì)基因的序列特異性抑制的新興技術(shù)之一，對(duì)人類疾病治療有巨大的潛力。本研究采用一種復(fù)合納米粒子作為RNA干擾的載體，沉默臍血DCs的SOCS1基因表達(dá)，為以DCs為基礎(chǔ)的抗腫瘤疫苗的研究提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞因子、抗體和試劑 HuGM-CSF、IL-4、TNF-α 購(gòu)自 MGI MegaGene公司。MTT、DMSO、IMDM購(gòu)自Sigma。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。兔抗人SOCS1多克隆抗體(H-93)、兔抗人β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自Santa Cruz。ECL增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，Opti-MEM?I低血清培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen。低分子量蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自TaKaRa。FITC 標(biāo)記的抗 CD1a、CD40、CD54、CD8、CD86 和HLA-DR抗體購(gòu)自BioLegend公司。IL-12 ELISA檢測(cè)試劑盒為達(dá)科為公司產(chǎn)品。

1.2 臍血和細(xì)胞株 臍血來(lái)源于吉林省婦幼保健院。臍血監(jiān)測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司。人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞株、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株和人肺癌A549細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3 SOCS1-siRNA序列的設(shè)計(jì)合成 針對(duì)人類SOCS1基因mRNA序列設(shè)計(jì)的siRNA寡核苷酸由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學(xué)合成。并通過(guò)Blast篩查，與人類基因外顯子沒(méi)有同源性。共合成了2對(duì)siRNA序列，序列1 sense 5'-GACUGAUUCCUAUUAAAUA-3'，antisense 5'-UAUU-UAAUAGGAAUCAGUC-3';序列2 sense 5'-GCAUU-AACUGGGAUGCCGUTT-3'，antisense 5'-ACGGCAUCCCAGUUAAUGCTG-3';陰性對(duì)照序列sense 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'，antisense 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3'，陰性對(duì)照用熒光染料FAM標(biāo)記。

1.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)臍血DCs 臍血DCs誘導(dǎo)培養(yǎng)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs細(xì)胞表面標(biāo)志詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)［3］。

1.5 設(shè)計(jì)合成復(fù)合納米粒子 復(fù)合納米粒子的構(gòu)建由東北師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院完成，詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)［4］。在Fe3O4納米粒子表面包覆了一層介孔結(jié)構(gòu)的二氧化硅外殼，然后在納米粒子表面包覆PEI分子。PEI分子具有正電荷，可以和帶有負(fù)電荷的siRNA結(jié)合，從而成為負(fù)載siRNA的一種有效的載體。由于有Fe3O4納米粒子的存在，在外加磁場(chǎng)存在的情況下，合成的納米粒子具有磁場(chǎng)導(dǎo)向的作用。

1.6 瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) 制備的納米粒子與siRNA序列以不同重量比混合(表1)，孵育15或30分鐘后，混合物在1%(w/v)瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色。

1.7 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)納米粒子-siRNA-FAM復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。實(shí)驗(yàn)分為空白組、LipofectamineTM2000-siRNA-FAM組、納米粒子-siRNA-FAM組、納米粒子-siRNA-FAM+磁鐵組、單獨(dú)納米粒子組、單獨(dú)siRNA-FAM組。靶細(xì)胞為HeLa細(xì)胞和臍血DCs。細(xì)胞被培養(yǎng)在6孔板中(1.0×106cells/ml)，24小時(shí)后，培養(yǎng)基更換為不含抗生素和血清的IMDM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后，轉(zhuǎn)染siRNA，實(shí)驗(yàn)方法參考LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)，稍作修改，每孔加入 siRNA 6 μl，LipofectamineTM2000 3 μl，納米粒子18 μl。轉(zhuǎn)染12 小時(shí)后，PBS洗細(xì)胞1次，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，Coulter Epics XL-MCL流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Expo32 ADC軟件獲取數(shù)據(jù)，收集5 000～10 000個(gè)細(xì)胞，Expo32 V1.2軟件分析數(shù)據(jù)。

1.8 Western blot檢測(cè)臍血DCs SOCS1基因沉默納米粒子結(jié)合傳遞的SOCS1-siRNA轉(zhuǎn)染臍血DCs后，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SOCS1蛋白表達(dá)，以β-actin做內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)分為空白組、LipofectamineTM2000-siRNA序列1組、納米粒子-siRNA序列1組、納米粒子-siRNA序列1+磁鐵組、LipofectamineTM2000-siRNA序列2組、納米粒子-siRNA序列2組、納米粒子-siRNA序列2+磁鐵組、A549陽(yáng)性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，RIPA全細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。12%SDS-PAGE凝膠電泳，在4℃冰箱中轉(zhuǎn)膜，蛋白被轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，BSA室溫封閉2小時(shí)，TBST洗3次;加入一抗(1∶250稀釋，4℃過(guò)夜)，TBST洗3次，每次10分鐘;加入二抗(1∶2 000稀釋，室溫孵育1小時(shí))，TBST洗3次，每次10分鐘;用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，X光片曝光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。

表1 Fe3O4@SiO2-PEI納米粒子與siRNA混合在不同重量比Tab.1 Fe3O4@SiO2-PEI nanoparticles mixed with siRNA in different weight ratio

1.9 MTT法評(píng)估臍血DCs誘導(dǎo)的抗腫瘤活性 首先制備腫瘤抗原:乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FCS的IMDM培養(yǎng)基中，0.25% 胰酶消化傳代。細(xì)胞呈指數(shù)期生長(zhǎng)時(shí)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107cells/ml，加入無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基，放入液氮中10分鐘，室溫融化，反復(fù)5次，用紫外分光光度計(jì)測(cè)蛋白濃度。采用自制的紅細(xì)胞裂解液分離臍血有核細(xì)胞，作為效應(yīng)細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/ml，接種于6孔板中，每孔3 ml。2小時(shí)后收集板中懸浮的細(xì)胞備用。臍血DCs的RNA干擾實(shí)驗(yàn)方法同前述，在干擾實(shí)驗(yàn)的前一天，加入腫瘤抗原，100 μl/孔。實(shí)驗(yàn)分組情況見(jiàn)表2，每組4重樣。各組經(jīng)不同處理后的臍血 DCs，每孔加入100 μl絲裂霉素溶液，作用30分鐘后，PBS洗2遍，細(xì)胞重新計(jì)數(shù)，按照DC∶T=1∶10的比例將DCs與效應(yīng)細(xì)胞混合培養(yǎng)，3天后收集細(xì)胞備用。采用MCF-7細(xì)胞作為靶細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)到指數(shù)期時(shí)，胰酶消化并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104cells/ml，接種于96孔板，每孔100 μl，第2天待細(xì)胞貼壁后，加入DCs刺激的效應(yīng)細(xì)胞，設(shè)2個(gè)效靶比，分別為25∶1和50∶1。繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，MTT法檢測(cè)各組DCs刺激的臍血T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。

表2 抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)分組Tab.2 Experiment group of antitumor actinities

1.10 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SOCS1-siRNA處理的各組臍血DCs培養(yǎng)上清中IL-12含量 實(shí)驗(yàn)分為空白組、LipofectamineTM2000-siRNA序列1組、納米粒子-siRNA序列1組、納米粒子-siRNA序列1+磁鐵組，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)培養(yǎng)的臍血DCs的表面標(biāo)志，結(jié)果見(jiàn)圖1。人DC成熟的主要標(biāo)志是CD1a、CD40、CD83和CD86等。CD1a常用于鑒定人外周血與骨髓中的DC，但在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)CD1a表達(dá)存在很大個(gè)體差異，有報(bào)道CD1a在DC成熟過(guò)程中表達(dá)有所降低，我們的檢測(cè)結(jié)果與此相符。

2.2 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。為證實(shí)納米粒子-siRNA的結(jié)合能力，納米粒子與siRNA混合后用瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖所示，siRNA的遷移被阻滯，證明納米粒子可以與siRNA結(jié)合，這種結(jié)合是通過(guò)靜電作用實(shí)現(xiàn)的。

2.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，目標(biāo)基因的敲除活性與siRNA結(jié)合、攝入和胞質(zhì)釋放特性相關(guān)。為確定納米粒子-siRNA復(fù)合物被細(xì)胞攝入的情況，我們檢查了細(xì)胞攝入和定位通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)。結(jié)果如圖3所示，納米粒子-siRNA復(fù)合物被清楚地觀察到在細(xì)胞質(zhì)中。流式檢測(cè)證明，單獨(dú)的FAM-siRNA能少量進(jìn)入腫瘤細(xì)胞中，但是不能進(jìn)入DCs中;納米粒子-siRNA復(fù)合物被腫瘤細(xì)胞攝入的效率高于 LipofectamineTM2000-siRNA，被 DCs細(xì)胞攝入的效率低于LipofectamineTM2000-siRNA;在外加磁場(chǎng)的作用下，納米粒子-siRNA復(fù)合物的細(xì)胞攝入效率顯著提高。

圖1 臍血DCs誘導(dǎo)培養(yǎng)11天表型檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Phenotype detections on cord blood dendritic cells in 11 d

圖2 納米粒子SOCS1-siRNA結(jié)合的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)Fig.2 Gel retardation assay of nanoparticles SOCS1-siRNA combination

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)評(píng)估基因沉默效果。為檢測(cè)RNAi的效率，我們測(cè)定了各組siRNA轉(zhuǎn)染后臍血DCs SOCS1蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果見(jiàn)圖4，SOCS1蛋白是細(xì)胞質(zhì)蛋白，分子量24 kD，單獨(dú)的納米粒子-SOCS1-siRNA序列復(fù)合物對(duì)SOCS1蛋白表達(dá)的抑制效率比LipofectamineTM2000低，在外加磁場(chǎng)的作用下，納米粒子-SOCS1-siRNA序列復(fù)合物顯著抑制臍血DCs細(xì)胞SOCS1蛋白表達(dá)。SOCS1-siRNA序列2與序列1相比沒(méi)有抑制作用，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用序列1。

圖3 siRNA復(fù)合物的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)流式檢測(cè)直方圖Fig.3 Histograms of siRNA complexes cellular uptake experiments

圖4 臍血DCs SOCS1蛋白表達(dá)Fig.4 SOCS1 protein expression on cord blood dendritic cells

圖5 SOCS1-siRNA轉(zhuǎn)染的臍血DCs活化的T細(xì)胞對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷作用Fig.5 The antitumor activities of T cells activated by SOCS1-siRNA transfected cord blood DCs on MCF-7 cells

圖6 SOCS1-siRNA處理的臍血DCs培養(yǎng)上清IL-12含量Fig.6 IL-12 contents of SOCS1-siRNA transfected cord blood DCs in culture supernatant

2.4 臍血DCs經(jīng)SOCS1-siRNA處理后抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。臍血DCs分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和納米粒子傳遞的siRNA處理后，經(jīng)絲裂霉素滅活，以1∶10的比例刺激效應(yīng)細(xì)胞。以MCF-7乳腺癌細(xì)胞為靶細(xì)胞，在效靶比50∶1和25∶1時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率結(jié)果如下，與對(duì)照組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。

2.5 ELISA檢測(cè)SOCS1-siRNA處理的各組臍血DCs培養(yǎng)上清IL-12的含量，結(jié)果見(jiàn)圖6。臍血DCs經(jīng)SOCS1-siRNA處理后3個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均有顯著增強(qiáng)的IL-12細(xì)胞因子的分泌(P＜0.05，vs空白組)，納米粒子-siRNA序列1+磁鐵組的IL-12含量雖然高于LipofectamineTM2000-siRNA序列1組和納米粒子-siRNA序列1組，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著差異。

3 討論

RNA干擾是由雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性mRNA降解過(guò)程。與常用的反義技術(shù)相比，RNA干擾抑制基因的表達(dá)不但高效特異，而且效應(yīng)持久、操作簡(jiǎn)便。采用RNA干擾技術(shù)對(duì)癌基因進(jìn)行選擇性的干預(yù)已成為腫瘤基因治療的新手段［5］。但是合成的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)在生理環(huán)境中降解比較快，細(xì)胞攝入差，缺乏靶向能力，阻礙了它的治療應(yīng)用。因此發(fā)展有效的傳遞載體對(duì)于siRNA治療是非常必要的。近年來(lái)各種非病毒陽(yáng)離子脂質(zhì)、聚合物和肽等已經(jīng)被利用以形成納米尺寸的絡(luò)合物，可以通過(guò)靜電作用與siRNA結(jié)合。這些載體保護(hù)siRNA免受核酸酶降解，促進(jìn)siRNA序列被靶細(xì)胞攝入［6］。

本實(shí)驗(yàn)中，我們采用東北師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院設(shè)計(jì)合成的復(fù)合納米粒子作為siRNA序列的傳遞載體。這種復(fù)合的納米材料具有納米尺寸的Fe3O4核心和介孔結(jié)構(gòu)的二氧化硅外殼，并在納米粒子表面包覆PEI分子，使粒子具有正電荷，可以和帶有負(fù)電荷的siRNA結(jié)合，結(jié)合效率通過(guò)瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)被證實(shí)。此外由于有Fe3O4納米粒子的存在，在外加磁場(chǎng)存在的情況下，合成的納米粒子具有磁場(chǎng)導(dǎo)向的作用。我們首先用HeLa細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以LipofectamineTM2000為對(duì)照，檢測(cè)了靶細(xì)胞攝入納米粒子-siRNA復(fù)合物的能力，證明納米粒子可以有效傳遞siRNA序列，其作用優(yōu)于LipofectamineTM2000;然而臍血DCs攝入納米粒子-siRNA復(fù)合物的能力不同于腫瘤細(xì)胞，單獨(dú)的納米粒子傳遞siRNA的能力低于LipofectamineTM2000，只有在外加磁場(chǎng)的作用下，納米粒子才能有效傳遞siRNA序列進(jìn)入靶細(xì)胞，并增強(qiáng)DCs刺激的效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤作用，其效率高于 LipofectamineTM2000。Western blot檢測(cè)和MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，這可能是由于誘導(dǎo)培養(yǎng)的臍血DCs的細(xì)胞體積比腫瘤細(xì)胞小，胞質(zhì)部分比例比較小的緣故。

2009年，Hong等［7］首次報(bào)道了 SOCS1對(duì)人類DCs抗原提呈的調(diào)節(jié)作用，他們發(fā)現(xiàn)SOCS1沉默的人PBMC來(lái)源的DCs體內(nèi)外啟動(dòng)自身抗原特異性CTL的能力增強(qiáng)，其機(jī)制可能與IL-12相關(guān)。與此相符，本研究采用ELISA法檢測(cè)各組臍血DCs培養(yǎng)上清IL-12的含量，結(jié)果表明臍血DCs經(jīng)SOCS1-siRNA處理后3個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均有顯著增強(qiáng)的IL-12細(xì)胞因子的分泌，而且納米粒子-siRNA序列1+磁鐵組的IL-12含量最高。由于SOCS1負(fù)調(diào)控多種細(xì)胞因子信號(hào)，因此尚需進(jìn)一步研究其他的細(xì)胞因子如 IFN-γ、IL-6、IL-1β 等在 SOCS1沉默的臍血DCs中的作用。

復(fù)合納米粒子作為傳遞siRNA的載體具有很多優(yōu)點(diǎn)，納米粒子比表面積大，具有生物親和性，易于在其表面偶聯(lián)特異性的靶向分子，使其免遭核酸酶的降解;粒子具有良好的分散性、溫和的合成條件、可重復(fù)合成，細(xì)胞毒性小。已知PEI是有毒的，特別是當(dāng)用較高劑量時(shí)，PEI本身的強(qiáng)正電荷會(huì)與細(xì)胞表面的負(fù)電荷發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用。而且這種相互作用如果過(guò)強(qiáng)，會(huì)限制納米粒子-siRNA復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中釋放siRNA，降低siRNA的作用。我們采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果表明，制備的PEI包覆的納米粒子-siRNA復(fù)合物沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。此外，有研究表明PEI結(jié)構(gòu)類似于單體鞭毛蛋白片段，可由 TLR5識(shí)別［8］。因此 PEI可作為一種新的TLR5激動(dòng)劑與多種TLR信號(hào)協(xié)同作用，激發(fā)DCs使之發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用。我們制備的PEI包覆的納米粒子是否具有這種性質(zhì)還需要進(jìn)一步研究。目前我們需要解決的主要問(wèn)題是保證不同批次制備的納米粒子的穩(wěn)定性并深入研究納米粒子-siRNA復(fù)合物處理臍血DCs后，DCs生物學(xué)活性和抗腫瘤活性的改變及其機(jī)制。

致謝:感謝東北師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院王春剛老師、張凌宇同學(xué)在實(shí)驗(yàn)及文章撰寫(xiě)過(guò)程中給予的指導(dǎo)與幫助。

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