張 娣 單士剛 陳 俊 劉川橋 梁智輝 翁秀芳 吳雄文

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，武漢430030)

HLA-G是一種非經(jīng)典的HLAⅠ類分子，主要表達在接觸母體組織的胎兒滋養(yǎng)層細胞上，被認為在維持母胎耐受中起重要作用。Abderrahim Naji等報道接受移植的病人排斥反應(yīng)程度與HLA-G在血清中的含量成反比［1］。DC在固有免疫與適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用［2］，未成熟DC有很強的攝取、加工和處理抗原的能力，而成熟DC則發(fā)揮很強的抗原提呈功能。HLA-G可以通過與抑制性受體結(jié)合誘導(dǎo)免疫耐受，這些抑制性受體主要包括 ILT2與ILT4，主要表達在 T、B、NK、DC和巨噬細胞等表面［3］。相對于可溶性HLA-G單體而言，HLA-G二聚體與這些抑制性受體的親和力更強，誘導(dǎo)免疫耐受的效應(yīng)則更強［4］。近年來有文獻報道可溶性HLA-G四聚體在體內(nèi)能夠抑制DC的成熟［5］，也有人報道可溶性HLA-G單體可通過DC抑制同種T細胞增殖，但對DC的成熟卻沒有影響［3］。本研究擬采用文獻中報道誘導(dǎo)DC成熟的幾種方法，在同一實驗條件下探討可溶性HLA-G二聚體對DC成熟的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源 武漢血液中心。

1.2 主要試劑 人外周血淋巴細胞分離液，天津市灝陽生物制品生產(chǎn)。rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α、IFN-γ均購自PeproTech公司。CD1a(HI149)、CD83(HB15e)單抗購自eBioscience公司。CD40(5C3)購自BioLegend公司。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，按照說明書配制。杭州四季青胎牛血清，56℃、30分鐘滅活后使用。可溶性HLA-G二聚體由本實驗室構(gòu)建與表達［6］。

1.3 DC的培養(yǎng) 取健康獻血者的外周血，用PBS對倍稀釋，外周血淋巴細胞分離液密度梯度離心(2 000 r/min，30分鐘)后，獲得外周血單個核細胞(PBMC)，PBS洗滌2～3次，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×108ml-1，接種到6孔板中，每孔2×107個細胞，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時，去掉懸浮細胞，每孔加3 ml培養(yǎng)基，并加入rhM-CSF與rhIL-4，終濃度分別為15 ng/ml和 10 ng/ml。5天后加入 TNF-α 或IFN-γ，終濃度為10 ng/ml。同時加入可溶性HLA-G二聚體上清，終濃度為0.8 μg/ml，并設(shè)置721.221上清組作為對照，于第7天收獲細胞。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察 在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，單核細胞在加入細胞因子后形態(tài)發(fā)生了明顯改變。

1.5 免疫表型檢測 流式細胞儀檢測DC的表面標志，收獲培養(yǎng)7天后的細胞，離心，每管加100 μl PBS和 CD1a、CD83、CD40單抗，混勻后4℃避光孵育30分鐘，每隔10分鐘振搖一次，再用PBS離心洗滌一次，最后每管細胞用200～300 μl PBS懸起，流式細胞儀檢測。

圖1 單核細胞經(jīng)GM-CSF、IL-4及TNF-α或 IFN-γ誘導(dǎo)7天后的DC形態(tài)(倒置相差顯微鏡，×400)Fig.1 The morphology of DC from monocyte induced by GM-CSF，IL-4 and TNF-α or IFN-γ (inverted phase contrast microscope，10×40 times)

2 結(jié)果

2.1 DC的形態(tài)觀察 新分離的外周血單個核細胞呈圓形，分散分布，大小均等，去掉懸浮細胞后的貼壁細胞在加入GM-CSF和IL-4后的第3～4天部分細胞開始呈半懸浮狀態(tài)，聚集成團，6到7天后半懸浮細胞增多，細胞團也明顯增多，細胞周圍出現(xiàn)大量樹枝狀棘突，呈現(xiàn)典型的DC形態(tài)，如圖1所示，與文獻報道一致［7］。

2.2 細胞免疫表型結(jié)果 CD1a表達在所有DC表面，CD83只表達在成熟DC表面，CD40隨著DC的成熟表達增加。流式儀檢測結(jié)果:單核細胞體外經(jīng)GM-CSF、IL-4及TNF-α或IFN-γ誘導(dǎo)為DC的典型散點圖，如圖2，TNF-α或IFN-γ誘導(dǎo)的成熟DC組、721.221上清組、可溶性HLA-G二聚體組CD1a+CD83+、CD1a+CD40+陽性率統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示:無論刺激DC成熟的是TNF-α還是IFN-γ，可溶性HLA-G二聚體組CD1a+CD83+、CD1a+CD40+陽性率明顯低于721.221上清組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。另外，由圖3還可以得出:IFN-γ刺激組成熟DC百分率與TNF-α刺激組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 單核細胞體外經(jīng)GM-CSF、IL-4及TNF-α或IFN-γ誘導(dǎo)成DC的典型散點圖Fig.2 The typical scatter diagram of DC from monocyte induced by GM-CSF，IL-4 and TNF-α or IFN-γ in ritro

表1 可溶性HLA-G二聚體體外可抑制樹突狀細胞的成熟(±s，%)Tab.1 The soluble of HLA-G dimer can inhibit the mature of DC in vitro(±s，%)

表1 可溶性HLA-G二聚體體外可抑制樹突狀細胞的成熟(±s，%)Tab.1 The soluble of HLA-G dimer can inhibit the mature of DC in vitro(±s，%)

Note:There is significant difference between these two groups，1)P ＜0.05.Mature DC 1，Supernatant of 721.221 1 and Soluble HLAG dimer 1 are induced by TNF-α.Mature DC 2，Supernatant of 721.221 2 and Soluble HLA-G dimer 2 are induced by IFN-γ.

Groups CD1a+CD83+ CD1a+CD40+Mature DC 1 40.58±18.23 76.63±12.10 Supernatant of 721.221 11) 40.14±12.23 75.02±15.35 Soluble HLA-G dimer 11) 29.95±17.87 41.69±20.71 Mature DC 2 36.50±18.84 60.49±18.75 Supernatant of 721.221 21) 35.86±13.51 58.29±14.17 Soluble HLA-G dimer 21)23.73±15.81 40.43±23.79

圖3 可溶性HLA-G二聚體在體外可抑制樹突狀細胞的成熟Fig.3 The soluble of HLA-G dimer can inhibit the mature of DC in vitro

3 討論

HLA-G是一種非經(jīng)典的 HLA-Ib類分子，與HLA-Ia抗原相比，HLA-G具有低度多態(tài)性和分布局限性的特點，主要在絨毛外細胞滋養(yǎng)細胞有高水平表達，這與HLA-G誘導(dǎo)母胎耐受的作用有關(guān)。其通過與免疫細胞表面抑制性受體結(jié)合來抑制廣泛的免疫反應(yīng)，如ILT2及ILT4［7］，這些抑制性受體主要表達在T、B、NK、DC和巨噬細胞等表面。文獻報道可溶性HLA-G二聚體與這些抑制性受體的親和力更強，誘導(dǎo)免疫耐受的作用更大。

DC在調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起重要作用。另外，還參與免疫耐受的建立。免疫耐受作用是通過特異性的DC亞群調(diào)節(jié)的，稱為耐受性DC，這群DC的免疫抑制作用是通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞產(chǎn)生的［8］。關(guān)于誘導(dǎo)DC的方法，曾有文獻報道用GMCSF、IL-4便可得到未成熟 DC［3］，在培養(yǎng)第 5 天加入TNF-α/IFN-γ/LPS可得到成熟DC。各種細胞因子的作用如下:GM-CSF能使單核細胞向DC及巨噬細胞分化。IL-4則能抑制巨噬細胞形成，促使DC定向誘導(dǎo)分化，并能維持DC于未成熟狀態(tài)。TNF-α可抑制粒細胞產(chǎn)生，同時可促進DC成熟。IFN-γ可激活單核細胞，促進DC表達MHCⅡ類分子，即可促進DC成熟。本實驗誘導(dǎo)DC方法與文獻報道一致。經(jīng)誘導(dǎo)后的DC在顯微鏡下可觀察到其典型形態(tài):半懸浮，成團，樹突狀。

根據(jù)文獻報道，可溶性HLA-G二聚體可通過與DC表面的抑制性受體結(jié)合而抑制DC的成熟，表現(xiàn)為共刺激分子如 CD80、CD86表達水平下降［9］，從而進一步誘導(dǎo)T、B細胞的免疫耐受。但也有文獻報道可溶性HLA-G二聚體可以抑制DC誘導(dǎo)的同種T細胞增殖，但并不影響 DC的分化與成熟［3］。本實驗首先分離人外周血中的PBMC，然后利用細胞因子 GM-CSF、IL-4及 TNF-α/IFN-γ刺激單核細胞得到DC，并探討可溶性HLA-G二聚體在DC成熟過程中的作用。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，刺激成熟的因子為TNF-α或IFN-γ時，可溶性HLA-G二聚體都可以抑制DC的成熟。結(jié)果還顯示:用TNF-α或IFN-γ作為刺激成熟的因子均可誘導(dǎo)DC成熟，但TNF-α刺激成熟的作用較 IFN-γ更強。關(guān)于HLA-G抑制DC成熟的機制，有文獻報道與IL-6-STAT3 信號通路有關(guān)［10］。

有文獻報道，CD40-CD40L(CD154)參與誘導(dǎo)耐受性DC，在自身免疫病、移植排斥反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受中發(fā)揮重要作用［11］。另有文獻報道，HLA-G與ILT4受體結(jié)合發(fā)揮的強大效應(yīng)或許在耐受性疫苗治療自身免疫性疾病的發(fā)展或維持移植免疫耐受等某些臨床應(yīng)用中有重要作用［11］。本實驗證實了可溶性HLA-G二聚體在體外可抑制DC的成熟，這或許對可溶性HLA-G二聚體在某些臨床疾病中的應(yīng)用提供線索。

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10 Siyuan Liang，Vladimir Ristich，Hisashi Arase et al.Modulation of dendritic cell differentiation by HLA-G and ILT4 requires the IL-6—STAT3 signaling pathway［J］.PNAS，2008;105(24):8357-8362.

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