吳飛云 林有坤 方 玲 袁志剛

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，南寧530021)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是典型的系統(tǒng)性自身免疫病，一種以自身抗體產(chǎn)生和免疫復(fù)合物形成為特點(diǎn)的自身免疫性疾病，其中經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)天然免疫和獲得性免疫在該病發(fā)病和病程的發(fā)展中都起了重要作用［1］。有研究結(jié)果認(rèn)為:SLE的易感性及臨床表型與遺傳因素密切相關(guān)。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類跨膜受體，通過識別并結(jié)合相應(yīng)病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern，PAMP)，可啟動激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并誘導(dǎo)某些免疫效應(yīng)分子(包括炎性細(xì)胞因子)表達(dá)。目前對TLR的研究揭示該通路系統(tǒng)調(diào)節(jié)著天然免疫系統(tǒng)與獲得性免疫系統(tǒng)之間的平衡，TLRs對其配體的識別，不但啟動了天然免疫系統(tǒng)，而且也激活并調(diào)控了獲得性免疫系統(tǒng)，與免疫缺陷性疾病、異常免疫應(yīng)答性疾病等疾病的發(fā)病有關(guān)［2-5］。

研究表明細(xì)菌鞭毛蛋白可以被人TLR5識別［6］。還有研究表明，TLR5的缺乏與防護(hù)非感染性炎癥有關(guān)［7］。對SLE遺傳學(xué)研究顯示共有50個左右基因位點(diǎn)與SLE有關(guān)，其中包括1q41-q42，這正好是TLR5基因所在位點(diǎn)［8］。Hawn等［9］在遺傳不平衡測試基礎(chǔ)上設(shè)計病例對照研究，對高加索包含199個病人和他們未患病的75名兄弟姐妹及326名父母的家系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)TLR5基因的C1174T(rs5744168)單核苷酸多態(tài)性與防護(hù)SLE有關(guān)，推測TLR5基因+1174等位基因C是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的危險因素，而等位基因T是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的保護(hù)因素;但另一項(xiàng)針對美國高加索病人的研究則未能證實(shí)這一結(jié)論［10］。以上提示TLR5及其rs5744168位點(diǎn)基因多態(tài)性在SLE致病中可能起一定的作用，并且這種作用可能會有種族差異，但是否與廣西壯族SLE相關(guān)，并且在廣西壯族SLE和廣西漢族SLE之間是否有差異有待證實(shí)，本文將對此進(jìn)行研究。

1 對象與方法

1.1 對象

1.1.1 研究對象 觀察組77例SLE患者為2010年5月至2011年8月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科住院病人，所有觀察病例均具有典型的臨床疾病表現(xiàn)，均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會制定的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。對照組72例系我院健康體檢者，經(jīng)病史、體檢及結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查排除1型糖尿病以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病。所有研究對象對本研究知情同意，并簽有知情同意書，均為無親緣關(guān)系的壯族或漢族人，均為廣西籍人且三代內(nèi)均為純壯族或漢族血統(tǒng)。觀察組和對照組構(gòu)成如表1。

1.1.2 儀器和試劑 百泰克全血基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型);BioTeke，2×Power Taq PCR Master Mix;百泰克，DNA 50 bp Marker;TIANGEN 6×DNA電泳Loading Buffer;上海生工，溴化乙錠;德國 Biometru，Tpersonal PCR 儀。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集受檢者靜脈血2 ml，EDTA抗凝，百泰克全血基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)提取白細(xì)胞基因組DNA，溶于洗脫緩沖液EB，－80℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計 參照 GenBank中 TLR5 DNA序列primer5.0設(shè)計引物(序列見表2)，由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

表1 觀察組和對照組構(gòu)成表Tab.1 Table of observation groups and control groups component

表2 TLR5 rs5744168基因引物序列Tab.2 TLR5 rs5744168 gene primer sequence

1.2.3 PCR擴(kuò)增條件 PCR反應(yīng)體系總體積50 μl，其中模板 DNA 6 μl，2 ×Power Taq PCR Master Mix 25 μl，上下游引物各 2 μl，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至 50 μl。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性3分鐘，95℃變性30秒，54℃的退火溫度復(fù)性30秒，72℃延伸45秒，40個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。以上反應(yīng)均在德國Biometru Tpersonal型的基因擴(kuò)增儀上完成。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物直接序列測定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行序列測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 計算各組基因型和等位基因頻率，然后多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在病例組中按ds-DNA陽性與ds-DNA陰性、ANA陽性與ANA陰性、有無腎損害時TLR5rs5744168多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率分布情況，校正了性別、年齡等混雜因素后，用卡方檢驗(yàn)分析TLR5rs5744168多態(tài)性與SLE臨床表現(xiàn)形式與實(shí)驗(yàn)室檢查的相關(guān)性，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義，使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 樣本DNA的提取結(jié)果 全血提取的DNA，均能跑出單一的亮的條帶，如圖1。

圖1 DNA電泳圖Fig.1 Agarose gel analysis of the extracted DNA

2.2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 DNA進(jìn)行PCR后均能看到409 bp的亮的目的條帶，如圖2。

圖2 TLR5 rs5744168 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The amplification results of TLR5 rs5744168 gene PCR products analyzed on agarose gel

2.3 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果 擴(kuò)增產(chǎn)物直接序列測定的結(jié)果，如圖3和圖4。

圖3 TLR5 rs5744168 C/C基因型擴(kuò)增產(chǎn)物測序圖(下劃線為C等位基因)Fig.3 The sequencing fig of amplified products of TLR5 rs5744168C/C genotype(Underscore for the C allele)

圖4 TLR5 rs5744168 C/T基因型擴(kuò)增產(chǎn)物測序圖(下劃線為T等位基因)Fig.4 The sequencing fig of amplified products of TLR5 rs5744168 C/T genotype(Underscore for the T allele)

2.4 統(tǒng)計分析結(jié)果

2.4.1 廣西壯族 SLE與漢族 SLE的TLR5 rs574 4168 C/T多態(tài)性的差異性分析 TLR5 rs5744168C/T基因型頻率以及相應(yīng)的C、T等位基因頻率，在兩個觀察組間、兩個觀察組與相應(yīng)對照組間的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)。見表3、4。

2.4.2 TLR5 rs5744168多態(tài)性位點(diǎn)與廣西SLE患者的臨床表現(xiàn)形式與實(shí)驗(yàn)室檢查的關(guān)聯(lián)性分析 表5顯示了在病例組中按ds-DNA陽性與ds-DNA陰性、ANA陽性與 ANA陰性、有無腎損害時 TLR5 rs5744168多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率分布情況。校正了性別、年齡等混雜因素后，用卡方檢驗(yàn)分析顯示，TLR5rs5744168這一SNP位點(diǎn)與ds-DNA、ANA和有無腎損害的發(fā)生間均不存在差異性(P ＞0.05)。

表3 廣西壯、漢族SLE組TLR5 rs5744168基因型頻率及等位基因頻率分析對比Tab.3 The contrastive analysis of TLR5 rs5744168 genotype frequency and allele frequency in patients with SLE between Guangxi Zhuang nationality and Han nationality

表4 廣西壯、漢族SLE組與壯、漢族對照組TLR5 rs5744168基因型頻率及等位基因頻率分析對比Tab.4 The contrastive analysis of TLR5 rs5744168 genotype frequency and allele frequency between Guangxi Zhuang and Zhuang control groups and between Han SLE group and Han control groups

表5 TLR5 rs5744168的基因多態(tài)性與廣西SLE患者相關(guān)臨床表型、實(shí)驗(yàn)室檢查的相關(guān)性分析Tab.5 The correlative analysis of TLR5 rs5744168 gene polymorphism and the related clinical phenotypes and laboratory examination of Guangxi patients with SLE

3 討論

目前SLE病因及發(fā)病機(jī)理尚未明確，致病因素可能有很多種，但是免疫遺傳因素在其發(fā)病中的作用已經(jīng)得到學(xué)界的廣泛認(rèn)同。在天然免疫中，宿主通過TLR5識別細(xì)菌的鞭毛蛋白(病原相關(guān)分子模式PAMPs)來介導(dǎo)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌。有研究表明，TLR5具有TLR同源域，可與CD4胞外區(qū)融合，造成TLR5組成性激活，進(jìn)而激烈激活核轉(zhuǎn)錄因子 κB(Nuclear factor κB，NF-κB)，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子 α(Tumour necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素6(Interleukin 6，IL-6)、白介素8(IL-8)的分泌。TLR5屬于限制性Toll樣受體，主要表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)和上皮細(xì)胞。而研究表明，DC與自身免疫性疾病的發(fā)生關(guān)系密切。

已知TLR5基因內(nèi)存在多個能引起氨基酸發(fā)生改變的SNP位點(diǎn)，尤其是外顯子6中能導(dǎo)致無義突變的位點(diǎn)rs5744168，可引起TLR5的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)部分的完全缺失，從而引起TLR5功能的喪失。Hawn等［9］發(fā)現(xiàn)TLR5 基因的C1174T(rs5744168)單核苷酸多態(tài)性與防護(hù)SLE有關(guān)，推測TLR5基因+1174等位基因C是SLE的危險因素，而等位基因T是SLE的保護(hù)因素。而Demirci［10］研究表明 TLR5基因rs5744168的基因多態(tài)性與SLE的危險性或保護(hù)性并不存在關(guān)聯(lián)性。由此我們推測，TLR5的遺傳變異很可能會影響SLE的發(fā)生風(fēng)險和病程進(jìn)展，并存在種族差異。

我們采用聚合酶鏈反應(yīng)和直接測序法對33例壯族、44例漢族SLE患者和72名壯漢族健康對照者進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR5 rs5744168 C/T基因型頻率和等位基因頻率均與廣西地區(qū)的壯、漢族SLE的發(fā)生風(fēng)險或保護(hù)性無關(guān)，也不存在民族間的差異性，與 Demirci［10］和 Sanchez［11］等的研究結(jié)果相吻合，但是與Hawn［9］等的研究結(jié)果相反。我們還發(fā)現(xiàn)TLR5 rs5744168這一SNP位點(diǎn)與廣西SLE是否ds-DNA陽性、ANA陽性和有無腎損害的發(fā)生間亦均不存在相關(guān)性，提示該位點(diǎn)與本區(qū)域內(nèi)SLE疾病進(jìn)展可能沒有相關(guān)性。但此結(jié)果不能排除與觀察的病例數(shù)偏少有關(guān)，因此TLR5基因多態(tài)性與廣西壯漢族SLE易感性間的確切關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步研究。

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