胡章立，李建成，程雪薇

深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳市海洋藻類(lèi)開(kāi)發(fā)應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室，深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳518060

萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一種單細(xì)胞光合真核藻類(lèi)，屬于綠藻門(mén)團(tuán)藻目衣藻科.它與酵母有許多共同之處，如生長(zhǎng)速度快且周期短;既可在固體平板培養(yǎng)基上形成單克隆，也可進(jìn)行液體培養(yǎng);以單倍體與二倍體兩種形式生長(zhǎng)等.藻類(lèi)是分子生物學(xué)、膜生物學(xué)和功能基因組學(xué)等研究領(lǐng)域的模式生物，其中最為典型的是萊因衣藻.作為單細(xì)胞真核綠藻，萊因衣藻具有生長(zhǎng)周期短，生長(zhǎng)迅速快，光合效率高等特點(diǎn).它已成為藻類(lèi)基因組計(jì)劃研究中的模式植物.因此，萊茵衣藻有“光合酵母”之稱［1］.此外，萊茵衣藻在光照下能進(jìn)行光合自養(yǎng)，而在黑暗和醋酸鹽條件下能進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng);有兩根鞭毛，可在水中自由游動(dòng);有眼點(diǎn)，具有感光能力等特征.20世紀(jì)50年代以來(lái)，萊茵衣藻作為模式生物在分子遺傳、鞭毛運(yùn)動(dòng)、光合作用、葉綠體起源、線粒體功能、趨光性和生理節(jié)律等領(lǐng)域扮演重要角色［2-5］.

萊茵衣藻具有細(xì)胞核基因組、葉綠體基因組和線粒體基因組3套遺傳系統(tǒng).核基因組和葉綠體基因組可方便有效地進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，其表達(dá)調(diào)控機(jī)理也得到較為深入的研究.由于其具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短、光合效率高和遺傳背景清楚等特點(diǎn)，萊茵衣藻被認(rèn)為是具有廣泛應(yīng)用前景的轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器，至今已有多種外源基因在萊茵衣藻細(xì)胞核和葉綠體中獲得成功表達(dá)［6-9］.近年來(lái)，基因槍轟擊技術(shù)的問(wèn)世，大幅提高了外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化效率，該技術(shù)通過(guò)自身攜帶的動(dòng)力系統(tǒng)將帶有DNA的金屬顆粒(一般為鎢?；蚪鹆?，以一定速度帶入受體細(xì)胞內(nèi)，由于金屬顆粒穿透力強(qiáng)，所以不需對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行破壁處理即可進(jìn)入基因組，從而實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化的目的.基因槍轟擊技術(shù)具有應(yīng)用面廣，方法簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化周期短等優(yōu)點(diǎn).然而，自Randolph-Anderson等［10］利用基因槍將野生萊茵衣藻完整的線粒體DNA轉(zhuǎn)化到萊茵衣藻呼吸作用缺陷型突變株dum-1，獲得具有正常呼吸特性的轉(zhuǎn)基因藻株以來(lái)，有關(guān)萊茵衣藻線粒體基因組遺傳轉(zhuǎn)化的研究很多，但成功進(jìn)行線粒體遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)道很少［11-13］，而線粒體遺傳轉(zhuǎn)化是研究線粒體基因功能、基因表達(dá)調(diào)控、線粒體與核質(zhì)間相互作用等生物學(xué)過(guò)程的重要途徑.本課題組Hu等［13］首次成功利用光合生物——萊茵衣藻線粒體遺傳系統(tǒng)表達(dá)了外源egfp基因，隨后又利用該系統(tǒng)成功表達(dá)了來(lái)自細(xì)菌的ble基因［14］.本文結(jié)合該課題組研究結(jié)果，評(píng)述萊茵衣藻線粒體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)及其外源基因表達(dá)的研究進(jìn)展.

1 萊茵衣藻線粒體基因組的結(jié)構(gòu)

Ryan等［15］從萊茵衣藻線粒體中分離純化出線粒體DNA.它在氯化銫溶液中的浮力密度為1.706 g/mL，在標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液中的溶解溫度為87.9℃，動(dòng)力學(xué)復(fù)雜度為9.78×106Da.電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，線性分子占99%，開(kāi)環(huán)或閉環(huán)分子少于1%.線狀或環(huán)狀的分子長(zhǎng)度均在4.0～5.4 μm.每個(gè)細(xì)胞內(nèi)線粒體基因的拷貝數(shù)約為50個(gè)，占細(xì)胞內(nèi)總DNA含量的0.6%.

萊茵衣藻線粒體基因組的測(cè)序已經(jīng)在1993年完成(Genbank序列號(hào):U03843)［16］.測(cè)序結(jié)果顯示，該線性 DNA分子全長(zhǎng)15 758堿基對(duì)(base pair，bp)，由13個(gè)基因組成(GC含量45%)，分別編碼細(xì)胞色素氧化酶c亞基Ⅰ(復(fù)合體Ⅵ)、細(xì)胞色素b(復(fù)合體Ⅲ)及還原型輔酶(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH);輔酶Q還原酶的5個(gè)亞基(復(fù)合體Ⅰ)，一個(gè)反轉(zhuǎn)錄蛋白，3個(gè)tRNA(trnW、trnQ和trnM)及組成大小核糖體亞基的rRNA.其中，rRNA基因的組成是不連續(xù)的，它被間隔成4個(gè)rrnS分子和8個(gè)rrnL分子而分散于線粒體基因組中.有研究表明，正常的rRNA是由這些小RNA分子通過(guò)廣泛的分子間相互作用而形成的［17］.在萊茵衣藻線粒體DNA中也存在非編碼序列，但其非編碼序列很短且不含內(nèi)含子.Vahrenholz等［16，18］的研究發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻線粒體基因組的末端有長(zhǎng)度為531 bp和532 bp的末端反向重復(fù)序列，還發(fā)現(xiàn)左右兩邊的3'端各有一段向外延伸的相同序列(長(zhǎng)度在39～41個(gè)核苷酸之間).末端重復(fù)序列每邊最外端的86個(gè)核苷酸都與中間的一段86個(gè)核苷酸的序列相同，這段序列位于L2b基因的3'端，距離基因組的右端674 bp［19］，詳見(jiàn)圖1.

2 萊茵衣藻線粒體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

2.1 萊茵衣藻線粒體DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯

圖1 萊茵衣藻線粒體基因組的基因分布［19］Fig.1 Gene organization of C.reinhardtii mitochondrial genome［19］

萊茵衣藻線粒體是具有半自主特性的細(xì)胞器，能單獨(dú)進(jìn)行DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成.與細(xì)胞核DNA復(fù)制一樣，線粒體DNA是以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，但兩條鏈的復(fù)制不同步，這與細(xì)胞核DNA準(zhǔn)確地在每個(gè)細(xì)胞分裂期只復(fù)制1次不同.Grant等［20］研究指出，萊茵衣藻線粒體基因組上兩個(gè)長(zhǎng)而非互補(bǔ)的單鏈末端避免了mtDNA自連成環(huán)狀，而且mtDNA的5'末端可被T4多核苷酸激酶有效標(biāo)記，這也排除了復(fù)制相關(guān)蛋白與這些末端通過(guò)共價(jià)結(jié)合而進(jìn)行復(fù)制的可能性.Vahrenholz等［16］也提出了兩種萊茵衣藻線粒體DNA復(fù)制模型，這兩種復(fù)制模型都以線粒體基因組中86 bp的內(nèi)部重復(fù)序列的存在為前提.

文獻(xiàn)［21］研究發(fā)現(xiàn)，在萊茵衣藻線粒體基因組中，13個(gè)功能基因分兩組排列在線性DNA分子的兩側(cè)，cob、nad4和nad5基因位于左邊，其轉(zhuǎn)錄方向是從 3'到5'端;cox1、nad2、nad6、nad1、rtl、rRNA及tRNA基因位于線粒體DNA右邊，其轉(zhuǎn)錄方向是從5'到3'端進(jìn)行.在nad5和cox1基因之間的間隔區(qū)有一小段序列起雙向啟動(dòng)子的作用，同一轉(zhuǎn)錄方向的基因組成一個(gè)操縱子，由公共雙向啟動(dòng)子共同啟動(dòng)它們的轉(zhuǎn)錄.但也有持相反觀點(diǎn)，因?yàn)閷?duì)轉(zhuǎn)錄圖譜的研究發(fā)現(xiàn)，有低水平的nad5基因前體RNA的5'端與cox1基因的起始位點(diǎn)相重疊［20］.在進(jìn)行線粒體基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，包括rRNA在內(nèi)的許多基因轉(zhuǎn)錄子的3'末端緊接著另一個(gè)轉(zhuǎn)錄子的5'末端.在3'末端非翻譯區(qū)的反向重復(fù)序列中包含能折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列，這些序列可能含有轉(zhuǎn)錄終止、RNA剪切加工和RNA穩(wěn)定等信息［22］.

萊茵衣藻線粒體與核基因組一樣利用通用密碼子編碼基因，但對(duì)密碼子具有很強(qiáng)的偏愛(ài)性［23］.在萊茵衣藻線粒體基因表達(dá)過(guò)程中，有9種密碼子根本未用到，有4種密碼子也僅在rtl基因中出現(xiàn)［19］.盡管在萊茵衣藻線粒體中缺失某些密碼子，但翻譯線粒體基因組信息至少需要23個(gè)tRNA［17］.然而，在萊茵衣藻mtDNA中卻只發(fā)現(xiàn)3個(gè)線粒體的tRNA基因，這說(shuō)明線粒體內(nèi)大部分的tRNA很可能是從線粒體外運(yùn)輸進(jìn)來(lái)的［24］.

2.2 萊茵衣藻線粒體遺傳轉(zhuǎn)化方法

相對(duì)細(xì)胞核轉(zhuǎn)化，將外源基因從細(xì)胞外導(dǎo)入線粒體是非常困難的，需要通過(guò)細(xì)胞膜和線粒體膜系統(tǒng).Johnson等［25］利用基因槍法成功地轉(zhuǎn)化了酵母(Saccharomyces cerevisiae)線粒體，將野生株的oxi3導(dǎo)入呼吸缺陷株(947/PA5)整合到線粒體基因組的同源位點(diǎn)，獲得具有細(xì)胞色素氧化酶活性的轉(zhuǎn)化株.Randolph-Anderson等［10］將基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用到萊茵衣藻線粒體遺傳轉(zhuǎn)化中，成功地將野生株CC-125中包含CYB基因的線粒體DNA左側(cè)片段導(dǎo)入呼吸缺陷突變株CC-2654中，獲得具有健全呼吸代謝功能的轉(zhuǎn)基因藻.目前萊茵衣藻線粒體遺傳轉(zhuǎn)化方法均采用基因槍法，其轉(zhuǎn)化效率由最初的每微克 DNA 獲得 7.3×10-7［10］個(gè)轉(zhuǎn)化子提高到現(xiàn)在的100～250個(gè)轉(zhuǎn)化子［12］.以下介紹本課題組開(kāi)展萊茵衣藻線粒體遺傳轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)操作步驟、技術(shù)參數(shù)和轉(zhuǎn)化效率等情況.

2.2.1 受體藻細(xì)胞制備

以萊茵衣藻作為遺傳轉(zhuǎn)化受體，采用“基因槍法”對(duì)外源基因進(jìn)行高效表達(dá)，必須要保證整個(gè)操作過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌.首先使用去離子水配置新鮮TAP培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌20 min、自然冷卻;然后將受體萊茵衣藻接種于TAP液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(約5×106～6×106mL-1);取25 mL上述藻液于50 mL離心管中離心收集藻細(xì)胞(6 000 r/min，20℃，1 min)，棄上清后加入約100 μL新鮮TAP液體培養(yǎng)基重懸藻細(xì)胞;將藻細(xì)胞懸液均勻地涂布于TAP固體平板中間(呈圓形，直徑約3 cm)，22℃，2 000 Lx下持續(xù)光培養(yǎng)1～2 d.

2.2.2 金粉準(zhǔn)備與DNA包被

稱取30 mg金粉(直徑 0.6 μm)置于 1.5 mL離心管中，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇劇烈振蕩3～5 min，浸泡15 min，離心去上清;加入1 mL無(wú)菌水渦旋且離心清洗3次，加500 μL體積分?jǐn)?shù)為50%的滅菌甘油，使金粉終質(zhì)量濃度達(dá)60 mg/mL;取50 μL充分混勻的金粉液于1.5 mL離心管中，并依次加入 5 μg 目的DNA(1 μg/μL)、50 μL 2.5 mol/L 的CaCl2和20 μL 0.1 mol/L 亞精胺(現(xiàn)配現(xiàn)用)，渦旋2～3 min，靜置1 min，短暫離心2 s，小心吸去液體;緩緩地加入140 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇漂洗沉淀，輕輕吸去液體;再緩緩地加入140 mL無(wú)水乙醇漂洗沉淀，輕輕吸去液體;最后加入48 mL無(wú)水乙醇，輕叩管壁重懸沉淀，低速渦旋2～3 s(使用時(shí)每槍涂布10 μL于微彈載體中心).

2.2.3 基因槍主要參數(shù)與轉(zhuǎn)化效率

以Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery system(Bio-Rad)為例，基于文獻(xiàn)［10-12］報(bào)道的萊茵衣藻線粒體的轉(zhuǎn)化參數(shù)，根據(jù)不同的轟擊距離、可裂膜規(guī)格組合成4組基因槍轉(zhuǎn)化參數(shù)(表1).

表1 基因槍轉(zhuǎn)化的主要參數(shù)組合*Table1 Summary of the major parameter combinations of microprojectile bombardment

比較4組基因槍轉(zhuǎn)化結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，組合④的轉(zhuǎn)化效率最高，每微克DNA能得到約600個(gè)轉(zhuǎn)化株，比Remacle等［12］轉(zhuǎn)化效率高2～3倍.

表2 不同參數(shù)組合對(duì)轉(zhuǎn)化株獲得個(gè)數(shù)的影響Table2 Numbers of transformants obtained by different parameter combinations

2.3 萊茵衣藻線粒體遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記基因

利用線粒體基因缺陷突變株進(jìn)行萊茵衣藻線粒體基因組遺傳轉(zhuǎn)化，是目前最主要的遺傳轉(zhuǎn)化篩選途徑.早期利用化學(xué)誘變的方法(吖啶黃和溴已啶染料等)，篩選到一系列呼吸缺陷型突變株［26-27］.在異養(yǎng)條件下，突變株細(xì)胞不能分裂，其生長(zhǎng)停滯;在兼養(yǎng)條件下(光照+醋酸鹽)，突變株細(xì)胞的總呼吸僅為野生型的20%～50%，其生長(zhǎng)速率下降;在光合自養(yǎng)條件下(光照但無(wú)醋酸鹽)，突變株的生長(zhǎng)與野生型的總呼吸率非常接近，生長(zhǎng)速率幾乎無(wú)差別.進(jìn)一步分子生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些突變株的基因突變位點(diǎn)來(lái)自線粒體，根據(jù)基因缺失或突變特性分為24種突變株，其中7種突變株(dum-1、dum-2、dum-3、dum-4、dum-11、dum-14和dum-16)是由于萊茵衣藻線粒體DNA左端不同長(zhǎng)度片段缺失，導(dǎo)致cob基因部分或全部缺失，使Complex III活性喪失［27］.目前應(yīng)用于線粒體遺傳轉(zhuǎn)化的突變株是萊茵衣藻呼吸缺陷型dum-1 mt-CC-2654，由于其線粒體DNA左端缺失了1.5 kb片段(包括terminvrep-left和cob)［26］，在黑暗條件下，它不能利用醋酸鈉作為碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)，Randolph-Anderson等［10］將野生型萊茵衣藻和史密斯(Chlamydomonas smithii)mtDNA轉(zhuǎn)入呼吸缺陷型dum-1 mt-CC-2654，在黑暗條件下，分別得到了修復(fù)缺失突變的轉(zhuǎn)化子.隨后報(bào)道的萊茵衣藻線粒體轉(zhuǎn)化研究均是利用導(dǎo)致藻細(xì)胞呼吸缺陷的cob基因作為篩選標(biāo)記［11-13］.

Mireau等［28］利用 barstar基因作為篩選標(biāo)記，成功地進(jìn)行了酵母(Saccharomyces cerevisiae)線粒體基因組的遺傳轉(zhuǎn)化.由于芽孢桿菌RNA酶能夠干擾線粒體基因的表達(dá).當(dāng)通過(guò)帶有barnase基因的質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中表達(dá)芽孢桿菌RNA酶時(shí)，導(dǎo)入到線粒體內(nèi)的芽孢桿菌RNA酶能夠抑制細(xì)胞的呼吸代謝，使酵母細(xì)胞在培養(yǎng)基上無(wú)法生長(zhǎng).barstar是芽孢桿菌RNA酶的抑制劑，將barstar基因整合到mtDNA，在酵母培養(yǎng)基上得到了轉(zhuǎn)化子.這說(shuō)明barstar能夠作為酵母線粒體轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記.這一篩選標(biāo)記不需要使用呼吸缺陷突變株，為多細(xì)胞生物線粒體轉(zhuǎn)化提供了可能的篩選途徑，但芽孢桿菌RNA酶作為一種細(xì)胞毒素，如何控制其表達(dá)量以免對(duì)受體生物產(chǎn)生影響是需要解決的問(wèn)題，這也大大限制了barstar作為線粒體轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的應(yīng)用.

Remacle等［12］曾嘗試?yán)没驑寣蓚€(gè)質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，其中一個(gè)質(zhì)粒攜帶核選擇標(biāo)記，另一個(gè)帶有線粒體目的基因.通過(guò)核轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記在光照下進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選后，再轉(zhuǎn)到黑暗中進(jìn)行線粒體轉(zhuǎn)化子篩選，但這一途徑未得到預(yù)期效果.

本課題組Hu等［4］成功地將egfp基因整合到萊茵衣藻線粒體基因組terminvrep-left和cob基因之間，轉(zhuǎn)基因藻在實(shí)驗(yàn)室保持培養(yǎng)兩年后，在激光共聚焦顯微鏡下能夠檢測(cè)到藻細(xì)胞線粒體中穩(wěn)定表達(dá)的綠色熒光蛋白.盡管egfp基因的表達(dá)量還需要提高，但該研究結(jié)果為萊茵衣藻線粒體基因組的遺傳轉(zhuǎn)化提供了一種新的篩選標(biāo)記.隨后Hu等［14］成功地將ble基因整合到萊茵衣藻線粒體基因組中，使轉(zhuǎn)基因藻細(xì)胞具有Phleomycin的抗性，這使線粒體外源基因轉(zhuǎn)化的篩選問(wèn)題變得容易，完全可以脫離之前依賴呼吸突變株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化篩選的局面.

3 外源基因在萊茵衣藻線粒體中的表達(dá)

外源基因遺傳轉(zhuǎn)化是在活體內(nèi)評(píng)估體外進(jìn)行的DNA改造結(jié)果和分析基因組內(nèi)由于新基因出現(xiàn)造成的顯型改變的唯一方法.利用線粒體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行外源基因表達(dá)具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值:一方面是研究線粒體基因表達(dá)調(diào)控、線粒體與核質(zhì)間相互作用等生物學(xué)過(guò)程的重要途徑［11，29］;另一方面是進(jìn)行線粒體基因工程操作的前提條件.如許多人類(lèi)疾病與線粒體DNA突變有關(guān)［30］，基因治療是根治線粒體疾病的有效措施.植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)與mtDNA密切相關(guān)［31］，針對(duì)CMS相關(guān)基因進(jìn)行mtDNA轉(zhuǎn)基因操作，大量培育出雜交育種所需要的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系、保持系和恢復(fù)系，將從根本上改變目前建立細(xì)胞質(zhì)雄性不育時(shí)，繁瑣地使用回交育種的方法［31］.然而，迄今為止，只有酵母(Saccharomyces cerevisiae)線粒體遺傳系統(tǒng)能夠進(jìn)行穩(wěn)定的外源基因表達(dá)［28，33］，在高等動(dòng)物和植物線粒體遺傳轉(zhuǎn)化中，只有體外離體線粒體轉(zhuǎn)化的報(bào)告［34-35］.

萊茵衣藻是唯一可以進(jìn)行細(xì)胞線粒體遺傳轉(zhuǎn)化的光合生物.然而，盡管萊茵衣藻核基因組和葉綠體基因組已可方便有效地進(jìn)行外源基因穩(wěn)定表達(dá)［6-9］，發(fā)現(xiàn)了很多用于篩選轉(zhuǎn)化株的標(biāo)記基因［36］，但線粒體異源功能基因表達(dá)研究進(jìn)展緩慢.關(guān)于萊茵衣藻線粒體遺傳轉(zhuǎn)化的研究迄今甚為少見(jiàn).Randolph-Anderson等［10］最早報(bào)道了萊茵衣藻線粒體遺傳轉(zhuǎn)化，他們用野生型萊茵衣藻和野生型史密斯衣藻的完整mtDNA，成功轉(zhuǎn)化了呼吸缺陷型萊茵衣藻dum-1突變株，得到能夠完全修復(fù)突變株呼吸缺陷的轉(zhuǎn)基因藻.在線粒體轉(zhuǎn)化過(guò)程中，DNA的整合方式是同源重組.與葉綠體［37］(每個(gè)處理細(xì)胞獲得1×10-4個(gè)轉(zhuǎn)化株)或核［38］(1×10-3)轉(zhuǎn)化相比，線粒體的轉(zhuǎn)化效率是很低的(0.8×10-7～12.5×10-7)［10］.Yamasaki等［11］分別構(gòu)建 4種萊茵衣藻mtDNA片段，包括5.0 kb(含左端反向重復(fù)序列、cob、nad4的C端67 bp序列、nad5的N端180 bp序列、雙向啟動(dòng)子序列、cox1、rRNA基因、ori和右端重復(fù)序列)、3.8 kb(與5.0 kb片段相比，cox1基因N端缺失1.2 kb)、1.8 kb(含左端反向重復(fù)序列、cob和nad4的C端67 bp序列)和3.2 kb PCR產(chǎn)物(包含cob和nad4).將4種mtDNA片段分別轉(zhuǎn)化5個(gè)萊茵衣藻呼吸缺陷突變株品系(dum-1、dum-14、dum-15、dum-16 和dum-19)，結(jié)果表明，因mtDNA左端反向重復(fù)序列和cob部分或全部缺失導(dǎo)致的呼吸缺陷突變株(dum-1、dum-14和dum-16)均得到轉(zhuǎn)化子(每平板約9～14)，而在突變株dum-15(cob的140密碼子TCT突變成TAC)和dum-19(在cox1的152密碼子-1T)則沒(méi)有通過(guò)同源重組得到轉(zhuǎn)化子.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻mtDNA左端末端及反向重復(fù)序列缺失可能有利于同源重組的發(fā)生，從而提高線粒體遺傳轉(zhuǎn)化效率.

Remacle等［12］利用高效基因槍轉(zhuǎn)化法進(jìn)行萊茵衣藻線粒體基因插入突變株的構(gòu)建.利用缺失1.2 kb片段(包括左端重復(fù)序列和cob基因)的呼吸缺陷突變株dum-11作為受體藻株，將包含左端重復(fù)序列和cob基因的不同長(zhǎng)度線粒體DNA片段導(dǎo)入衣藻線粒體，得到了較高的轉(zhuǎn)化效率(每微克DNA獲得100～250個(gè)轉(zhuǎn)化株).進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，線性化的mtDNA有利于提高轉(zhuǎn)化效率;mtDNA的端粒區(qū)能夠提高線粒體遺傳轉(zhuǎn)化效率，但并不是必需的因素;當(dāng)mtDNA的左側(cè)端粒區(qū)缺失時(shí)，右側(cè)端粒區(qū)序列能夠通過(guò)拷貝來(lái)構(gòu)建左側(cè)端粒序列.另外，通過(guò)萊茵衣藻線粒體轉(zhuǎn)化，有害突變和無(wú)害突變能夠被引入，如通過(guò)cob基因的單核苷酸替換篩選到粘噻唑抗性的突變株，含缺失23密碼子nad4基因突變株構(gòu)建等，這些結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展線粒體起源、定點(diǎn)突變及反向遺傳學(xué)提供了參考.

Hu等［13-14］將編碼綠色熒光蛋白的egfp和ble基因分別插入萊茵衣藻mtDNA的terminvrep-left和cob基因之間，構(gòu)建包含terminvrep-left、ble、cob和nad4部分片段的表達(dá)載體pBsLPNCG及pBsLPNCB，并利用基因槍將其分別導(dǎo)入萊茵衣藻dum-1突變株CC-2654線粒體中，獲得能夠有效表達(dá)綠色熒光白的轉(zhuǎn)基因藻和具有Phleomycin抗性的轉(zhuǎn)基因藻.據(jù)檢索了解，這是迄今國(guó)際上首次利用光合生物線粒體遺傳系統(tǒng)成功表達(dá)外源功能基因的報(bào)道.

4 存在問(wèn)題與展望

萊茵衣藻線粒體遺傳系統(tǒng)的基因組結(jié)構(gòu)已經(jīng)非常清楚，但線粒體基因的表達(dá)調(diào)控及其與細(xì)胞核和葉綠體基因組的協(xié)同關(guān)系等問(wèn)題，是下一步需要解決的重要問(wèn)題.外源基因在萊茵衣藻線粒體遺傳系統(tǒng)中的穩(wěn)定表達(dá)是研究這些問(wèn)題的基礎(chǔ).盡管近年已取得重要進(jìn)展，但仍存在以下問(wèn)題:

1)遺傳轉(zhuǎn)化株的異質(zhì)性問(wèn)題.由于萊茵衣藻細(xì)胞中線粒體基因組有30～50個(gè)拷貝，在轉(zhuǎn)基因操作時(shí)并不是每個(gè)線粒體基因組中都導(dǎo)入了外源基因，這就出現(xiàn)同一藻細(xì)胞不同基因組拷貝中出現(xiàn)含有外源基因和沒(méi)有整合外源基因的異質(zhì)體轉(zhuǎn)化株，隨著轉(zhuǎn)基因藻的亞克隆篩選，使異質(zhì)體的基因組分離，最后得到全部包含外源基因的同質(zhì)化轉(zhuǎn)化株.在萊茵衣藻葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，這種同質(zhì)化過(guò)程非?？欤?8］，但依賴呼吸缺陷突變株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到的轉(zhuǎn)化子線粒體同質(zhì)化過(guò)程則很緩慢，要經(jīng)過(guò)2～3個(gè)月的黑暗培養(yǎng)后，才能檢測(cè)到異質(zhì)化轉(zhuǎn)化子的亞克隆株［12］.可見(jiàn)，尋找更有效的遺傳轉(zhuǎn)化株篩選方法，在短時(shí)間內(nèi)獲得全部包含外源基因的同質(zhì)化轉(zhuǎn)化株，將是萊茵衣藻線粒體遺傳轉(zhuǎn)化研究的重點(diǎn).

2)遺傳轉(zhuǎn)化株的高效篩選途徑.利用呼吸缺陷突變株作為轉(zhuǎn)基因受體藻株，轉(zhuǎn)化子線粒體基因組因?yàn)檎狭送蛔冎耆笔У腸ob片段而能在黑暗中生長(zhǎng)而得以篩選出來(lái).這種轉(zhuǎn)化子篩選途徑在高等多細(xì)胞生物中不容易實(shí)現(xiàn)，因?yàn)楹粑毕莺筮@些生物將不可能存活［28］.至今，尚未找到高效抗生素抗性基因能夠在線粒體中穩(wěn)定表達(dá)，這大大制約了線粒體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的發(fā)展.

3)萊茵衣藻線粒體基因表達(dá)調(diào)控問(wèn)題.雖然萊茵衣藻線粒體遺傳系統(tǒng)表達(dá)外源基因已經(jīng)獲得成功，外源基因在轉(zhuǎn)基因藻中的表達(dá)水平是比較低的［13］，究其原因可能包括:① 在線粒體表達(dá)載體中，并沒(méi)有額外的啟動(dòng)子和其他的增強(qiáng)序列，egfp只能利用mtDNA中的雙向啟動(dòng)子跟隨cob基因進(jìn)行本底水平的轉(zhuǎn)錄表達(dá);②萊茵衣藻線粒體具有很強(qiáng)的密碼子偏愛(ài)性，雖然編碼egfp基因的密碼子大部分都符合萊茵衣藻線粒體的偏愛(ài)密碼子，但也有少數(shù)幾個(gè)密碼子并不常有，這有可能影響egfp基因的表達(dá)水平;③ 缺少萊茵衣藻線粒體基因5'UTR和3'UTR也可能導(dǎo)致egfp基因缺少適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控，5'UTR和3'UTR被認(rèn)為與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控密切相關(guān)，可能具有翻譯起始、維持mRNA的穩(wěn)定性、mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾和保證翻譯效率等功能;④在萊茵衣藻mtDNA基因中，有一段公共的序列(5'AAAUUUAU 3')被確定能與核糖體小亞基末端序列互補(bǔ)，這段序列在一般位于ATG起始密碼子上游3～7 bp處，缺少這些非編碼序列，有可能影響 ble的表達(dá)水平［40］.

由于基因表達(dá)調(diào)控極為復(fù)雜，萊茵衣藻線粒體外源基因表達(dá)調(diào)控涉及包括整合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄活性、核質(zhì)互作和翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)等方面的調(diào)控，將是今后相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)需要解決的重點(diǎn)難題.

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