陳勇軍 鄭 薇 牛志遠(yuǎn) 吳 珍 沈萍萍

(南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210093)

腫瘤是一個(gè)由多種細(xì)胞組成的異質(zhì)性組織。除了腫瘤細(xì)胞之外，在腫瘤微環(huán)境中還存在多種類型的非腫瘤細(xì)胞，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)成纖維細(xì)胞以及一些骨髓來(lái)源的免疫細(xì)胞(如髓源性抑制細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞等)[1]。其中髓源性抑制細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一類不成熟的髓細(xì)胞，由單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和髓系祖細(xì)胞等構(gòu)成[2]。小鼠的MDSCs細(xì)胞表面能特征性地表達(dá)CD11b和Gr-1。根據(jù)形態(tài)上的差別，MDSCs可進(jìn)一步分為單核的髓源性抑制細(xì)胞(Monocytic-MDSCs，M-MDSCs)和多形核的髓源性抑制細(xì)胞(Polymorphonuclear-MDSCs，PMN-MDSCs)[3]。MDSCs在腫瘤病人和荷瘤小鼠中會(huì)大量擴(kuò)增，并在血液、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟和腫瘤等部位積累。MDSCs能抑制T細(xì)胞的功能，削弱機(jī)體的免疫監(jiān)視和抗腫瘤免疫，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[4]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是腫瘤微環(huán)境普遍存在的一類非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，幾乎所有的實(shí)體瘤都能招募TAMs。TAMs具有與M2型巨噬細(xì)胞類似的表型，能夠促進(jìn)血管新生、基質(zhì)重塑。TAMs具有促腫瘤的能力;腫瘤病人中TAMs的密度與不良的預(yù)后密切相關(guān)[5]。

caspase-1屬于胱天蛋白酶家族中的一員，它能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展中有密切聯(lián)系。臨床研究發(fā)現(xiàn)，caspase-1的表達(dá)在結(jié)腸癌、前列腺癌和卵巢癌等腫瘤中是下調(diào)的，而過表達(dá)caspase-1則能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[6-8]。caspase-1作為典型的炎癥相關(guān)caspase，還能夠調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)和機(jī)體的抗腫瘤免疫。在腸炎相關(guān)的結(jié)腸癌模型中，炎癥小體(Inflammasome)介導(dǎo)caspase-1的激活和IL-18的釋放可以有效保護(hù)上皮細(xì)胞的完整性，并能防止腸炎和結(jié)腸癌的發(fā)生[9-11]。而壞死的腫瘤細(xì)胞釋放出的危險(xiǎn)信號(hào)可以激活NLRP3炎癥小體和IL-1β的釋放，并誘發(fā)IL-1β依賴性的獲得性免疫，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)[12]。這些結(jié)果揭示caspase-1具有重要的抗腫瘤功能。然而caspase-1對(duì)于腫瘤微環(huán)境中各種對(duì)腫瘤發(fā)展起促進(jìn)作用的骨髓來(lái)源細(xì)胞(如MDSCs、TAMs)的調(diào)控作用還不是清楚。

本研究中我們利用4T1細(xì)胞成功構(gòu)建了原位種植性乳腺癌模型，并在此模型中發(fā)現(xiàn)，caspase-1特異性抑制劑Ac-YVAD-CMK(YVAD)能夠促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，YVAD能夠促進(jìn)荷瘤小鼠外周血、脾臟和腫瘤部位MDSCs的積累;而不影響腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)的浸潤(rùn)和分化。因此，這些結(jié)果揭示caspase-1能夠通過負(fù)調(diào)控腫瘤微環(huán)境中MDSCs細(xì)胞的發(fā)育而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/c雌性小鼠(8～10周齡)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新生物公司。CD11b-PE、F4/80-FITC抗體和anti-F4/80抗體購(gòu)自eBioscience，Gr-1-PerCP-Cy5.5購(gòu)自 BD Bioscience，Ac-YVAD-CMK購(gòu)自Bachem，M-CSF購(gòu)自Peprotech，Collagase IV和DNase I購(gòu)自 Sigma。

1.2 原位種植性乳腺癌模型和給藥 BALB/c雌性小鼠(8～10周齡)飼養(yǎng)于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房中。小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM(購(gòu)自Invitrogen)中，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞，用PBS重懸，控制其密度為1×107cells/ml。取10 ml細(xì)胞懸液接種于BALB/c小鼠左側(cè)的前肢和后肢脂肪乳腺脂肪墊處。腫瘤接種后第5天開始給藥Ac-YVAD-CMK，劑量為5 mg/kg，每天腹腔注射一次(YVAD組);溶劑對(duì)照組注射相同量的DMSO(DMSO組)。另設(shè)未接種4T1腫瘤細(xì)胞的、注射DMSO的正常小鼠組(None)。在指定時(shí)間處死小鼠，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.3 骨髓細(xì)胞的分離 運(yùn)用短頸法處死小鼠，并用酒精消毒。在超凈臺(tái)內(nèi)用手術(shù)剪在股骨關(guān)節(jié)外側(cè)靠近脊柱位置剪下其后肢，然后剃出肌肉和結(jié)締組織。將股骨和脛骨間的兩端的關(guān)節(jié)剪開，用注射器吸取RPMI 1640(購(gòu)自Invitrogen)，并將骨髓細(xì)胞吹到培養(yǎng)皿里面。用40 μm濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中。1 200r/min，離心10分鐘，棄上清，加入1 ml紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，并再次離心。用RPMI1640重懸細(xì)胞，加入M-CSF(100 ng/ml)誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，或用于后續(xù)的流式細(xì)胞儀分析。

1.4 腫瘤細(xì)胞的分離 取出腫瘤組織，置于培養(yǎng)皿中，PBS洗滌一次，然后剪碎。加入適量的膠原酶液(含 1 mg/ml collagase IV 和 300 U/ml DNase I的Hanks溶液)，用注射器的末端充分研磨，放在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行消化，共消化大約30分鐘，每隔十分鐘搖晃一下。將上述組織液用100 μm的濾網(wǎng)過濾至50 ml的離心管中，再用40 μm濾網(wǎng)過濾一次。低速離心一次(500 r/min，1分鐘)，然后1 200 r/min離心10分鐘，并用PBS重復(fù)洗滌一次。PBS重懸細(xì)胞用于后續(xù)的流式細(xì)胞分析。

1.5 流式分析 收集細(xì)胞于1.5 ml Eppendorf(EP)管中，1 800 r/min離心5分鐘 (4℃)，再用含2%BSA的PBS洗滌一次。然后加入100 μl抗體工作液(1∶20稀釋)，重懸細(xì)胞;陰性對(duì)照樣品中加入相應(yīng)的同型IgG熒光抗體。冰上避光孵育30分鐘，期間不斷搖動(dòng)EP管，以防止細(xì)胞沉積。用預(yù)冷的PBS洗滌3次，1 800 r/min離心5分鐘。加500 μl PBS重懸細(xì)胞后上樣進(jìn)行流式分析。

1.6 免疫組化 取出腫瘤組織樣本，保存于4%多聚甲醛溶液中，然后石蠟包埋并進(jìn)行切片處理。后續(xù)操作步驟按照免疫組化試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。首先對(duì)切片進(jìn)行脫蠟水化處理和抗原修復(fù)處理，并使用3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶。然后使用山羊血清室溫封閉10分鐘，加入 F4/80抗體(1∶50稀釋)，室溫孵育1小時(shí);洗滌后加入對(duì)應(yīng)二抗(1∶50稀釋)，室溫孵育10～15分鐘。接著使用DAB顯色5～10分鐘，蘇木精復(fù)染3～4分鐘，自來(lái)水沖洗干凈。最后乙醇脫水，二甲苯洗滌3次，中性樹脂封片。經(jīng)免疫組化染色后的切片便可進(jìn)行顯微鏡拍照觀察和分析。

2 結(jié)果

2.1 YVAD促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng) YVAD能夠加劇脾腫大并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng) 小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1注射到BALB/c雌性小鼠乳腺脂肪墊后，能夠在注射部位形成腫瘤原發(fā)灶，同時(shí)還能產(chǎn)生轉(zhuǎn)移;其病理特征與人體中的乳腺癌十分相近，是研究乳腺癌的理想動(dòng)物模型[13]。我們?cè)?～10周齡BALB/c雌性小鼠左側(cè)乳腺脂肪墊中注入105個(gè)4T1細(xì)胞，大約一個(gè)星期后可以觀察到黃豆大小的腫瘤原位灶的形成(結(jié)果未顯示);而接種后第15天時(shí)可觀察到體積明顯增大的實(shí)體腫瘤(圖1A)。在接種腫瘤細(xì)胞后的第5天，我們將小鼠隨機(jī)分組，每組6～7只，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射YVAD(5 mg/kg)，對(duì)照組則注射相同體積的DMSO。然后分別在腫瘤種植后的第10、15和20天處死小鼠。我們發(fā)現(xiàn)第20天時(shí)YVAD給藥組中腫瘤重量顯著高于DMSO組(圖1B)。與正常小鼠比較，DMSO組和YVAD組中荷瘤小鼠的脾臟都明顯腫大，而YVAD給藥組較DMSO組的脾腫大程度更為嚴(yán)重(圖1C和 D)。以上結(jié)果表明，抑制caspase-1的活性能夠加劇乳腺癌荷瘤小鼠的脾腫大程度并促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。

2.2 YVAD促進(jìn)外周血和脾臟中PMN-MDSCs的積累 YVAD給藥會(huì)加重荷瘤小鼠體內(nèi)脾腫大的程度(圖1D)，這提示caspase-1的活性可能與免疫細(xì)胞的發(fā)育相關(guān)。為了系統(tǒng)性地研究YVAD給藥對(duì)于荷瘤小鼠體內(nèi)MDSCs細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控作用，我們對(duì)其外周血、脾臟和骨髓中的MDSCs細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，與正常小鼠相比，荷瘤小鼠的外周血中FSChiSSChi細(xì)胞所占比例顯著增加(P＜0.01)，而FSClowSSClow細(xì)胞數(shù)量則顯著減少(P＜0.01);并且YVAD給藥能進(jìn)一步改變 FSChiSSChi和 FSClowSSClow細(xì)胞數(shù)量的比例(圖2A)。PMN-MDSCs細(xì)胞通常表現(xiàn)為FSChiSSChi，于是我們對(duì)FSChiSSChi這一群細(xì)胞進(jìn)行了表型分析。我們分別在接種腫瘤細(xì)胞后的第15天和第20天對(duì)各組小鼠的外周血、脾臟和骨髓中的PMN-MDSCs(CD11b+Gr-1+SSChi)細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。第15天時(shí)的分析結(jié)果表明YVAD給藥能夠顯著增加外周血和脾臟中PMNMDSCs細(xì)胞的數(shù)量(P值分別為0.009 2和0.004 8)，而對(duì)于骨髓中PMN-MDSCs細(xì)胞沒有明顯的影響(圖2B-D)。而第20天的結(jié)果則顯示YVAD給藥沒有顯著改變荷瘤小鼠各組織中PMNMDSCs的比例(圖2E)。綜上，乳腺癌的發(fā)展伴隨著外周血和脾臟中 PMN-MDSCs細(xì)胞的積累，而caspase-1的活性能夠調(diào)控腫瘤發(fā)展早期PMN-MDSCs細(xì)胞的發(fā)育。

圖1 在種植性原位乳腺癌模型中抑制caspase-1的活性能夠加劇脾腫大并促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)Fig．1 Inhibition of caspase-1 aggravated splenomegaly and accelerated tumor growth in orthotopic model of breast cancer

2.3 YVAD能增加腫瘤部位MDSCs的比例 伴隨著腫瘤的發(fā)展，腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放一些細(xì)胞因子或化學(xué)因子而招募多種炎性細(xì)胞至腫瘤微環(huán)境中[1]。我們運(yùn)用H＆E染色對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(10天和15天)的腫瘤組織病理學(xué)特征進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，DMSO組和YVAD組中腫瘤組織邊緣部位均有部分炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，并且隨著腫瘤的發(fā)展炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度增加(圖3A)。而腫瘤組織中央部位炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量較少;隨著腫瘤體積的增大，腫瘤組織內(nèi)部出現(xiàn)了部分壞死區(qū)域(圖3B)。以上結(jié)果表明，腫瘤的發(fā)展伴隨了炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，同時(shí)腫瘤中央部位會(huì)出現(xiàn)壞死的狀況;然而整體上來(lái)看，YVAD給藥對(duì)于腫瘤組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況和細(xì)胞壞死情況沒有明顯影響。

為了分析腫瘤組織中MDSCs細(xì)胞的數(shù)量，我們運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)于細(xì)胞表面特征分子CD11b和Gr-1的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，CD11b和Gr-1雙染后可以將腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞分為四個(gè)亞群;與DMSO組相比，YVAD給藥組中MDSCs(CD11b+Gr-1+)比例明顯增加，由10.2%增加到19.8%，而 CD11b+Gr-1-細(xì)胞數(shù)量變化不大(圖3C)。對(duì)于流式結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，給藥組和對(duì)照組中MDSCs的數(shù)量具有顯著的差異(圖3D)。這些結(jié)果表明caspase-1的活性在MDSCs的發(fā)育和積累中發(fā)揮負(fù)調(diào)控的作用。

圖2 YVAD促進(jìn)外周血和脾臟中PMN-MDSCs細(xì)胞的積累Fig．2 YVAD treatment promoted expansion of PMN-MDSCs in peripheral blood and spleen

圖3 YVAD誘導(dǎo)腫瘤組織中CD11b+Gr-1+細(xì)胞的積累Fig．3 Accumulation of CD11b+Gr-1+cells in tumor microenvironment induced by YVAD treatment

2.4 YVAD不影響TAMs的招募和分化 TAMs腫瘤微環(huán)境中普遍存在的一類非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，有研究表明M-MDSCs細(xì)胞具有分化為TAMs的能力[5]。為了分析MDSCs比例的變化是否會(huì)影響TAMs的比例，我們運(yùn)用CD11b和F4/80雙染的方法檢測(cè)了腫瘤組織中TAMs(CD11b+F4/80+)的比例。結(jié)果顯示，對(duì)照組和YVAD給藥組中TAMs細(xì)胞的數(shù)量比例分別為8.18%和10.2%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析流式數(shù)據(jù)表明，DMSO和YVAD組中TAMs的比例沒有顯著的差異(P=0.54)(圖4A)。我們還運(yùn)用免疫組化的方法分別檢測(cè)了第10天和第15天的腫瘤組織中巨噬細(xì)胞(F4/80+)浸潤(rùn)情況。結(jié)果顯示，第15天時(shí)TAMs的浸潤(rùn)明顯比第10天時(shí)增多;而YVAD給藥組和DMSO組之間比較，TAMs的浸潤(rùn)情況并無(wú)顯著差異(圖4B)。我們還在體外考察了YVAD對(duì)于單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞分化的調(diào)控作用。如圖4C所示，DMSO對(duì)照組和YVAD給藥組(25 μmol/L、50 μmol/L)中 F4/80+細(xì)胞的比例分別為 68.9%、62.1%和58.7%。對(duì)于平均熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，YVAD給藥對(duì)于單核-巨噬細(xì)胞的分化過程沒有顯著地調(diào)控(圖4D)。因此，YVAD不能調(diào)控腫瘤微環(huán)境中TAMs的招募和分化。

3 討論

圖4 YVAD對(duì)腫瘤組織中TAMs的調(diào)控Fig．4 Regulation of TAMs recruitment and differentiation by YVAD treatment

MDSCs是由不成熟的髓細(xì)胞(Immature myeloid cells，IMCs)發(fā)育形成的，多種細(xì)胞亞群組成的抑制性細(xì)胞。正常情況下，IMCs細(xì)胞能夠遷移到外周器官，并進(jìn)一步分化成為巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞或粒細(xì)胞。但是在腫瘤、炎癥或感染等病理情形下，微環(huán)境中的細(xì)胞因子(如 IL-1β、IFN-γ、GM-CSF 等)可以促進(jìn)MDSCs的招募和活化，同時(shí)阻止其分化為成熟的細(xì)胞。腫瘤微環(huán)境中的MDSCs可以幫助腫瘤細(xì)胞逃脫機(jī)體的免疫效應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。因此，通過調(diào)控MDSCs細(xì)胞的發(fā)育過程(促進(jìn)MDSCs的分化或抑制MDSCs的增殖)可以有效激活機(jī)體免疫功能，抑制腫瘤生長(zhǎng)[2]。

caspase-1能夠通過對(duì)一些特異性底物的加工而發(fā)揮其生物學(xué)功能，其中pro-IL-1β和pro-IL-18是caspase-1最經(jīng)典的兩種底物。研究發(fā)現(xiàn)，caspase-1介導(dǎo)的IL-1β的釋放能夠參與調(diào)控多種免疫細(xì)胞的發(fā)育，如 TH17 細(xì)胞和 MDSCs等[14，15]。我們首先證實(shí)了caspase-1特異性抑制劑YVAD能夠促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展，同時(shí)還能加劇脾腫大的程度(圖1D)?；谠摤F(xiàn)象，我們展開了關(guān)于caspase-1調(diào)控腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞發(fā)育的功能分析。與文獻(xiàn)報(bào)道一致[2]，在乳腺癌荷瘤小鼠的外周血、脾臟、骨髓以及腫瘤組織中有大量MDSCs細(xì)胞的積累，特別是PMN-MDSCs細(xì)胞。YVAD給藥能夠進(jìn)一步增加外周血、脾臟和腫瘤部位PMN-MDSCs細(xì)胞的比例，但是對(duì)于骨髓中的PMN-MDSCs細(xì)胞影響不大。值得注意的是，在第15天時(shí)YVAD給藥組和DMSO對(duì)照組比較荷瘤小鼠脾腫大程度有顯著性差異，而在第20天時(shí)這兩組間脾腫大程度的差異很小。與此一致，我們發(fā)現(xiàn)PMN-MDSCs細(xì)胞的比例在第15天時(shí)受YVAD給藥的影響較大，而在第20天時(shí)YVAD給藥的調(diào)控作用則不明顯。這表明caspase-1調(diào)控荷瘤小鼠體內(nèi)免疫細(xì)胞發(fā)育的效應(yīng)主要體現(xiàn)在腫瘤發(fā)展的早期;而在腫瘤發(fā)展的晚期，由于腫瘤細(xì)胞壞死導(dǎo)致 caspase-1活性的增強(qiáng)[12]，因而 YVAD效應(yīng)則被部分抑制。

雖然caspase-1在TH17和MDSCs的細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用，但是caspase-1對(duì)于單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞的分化卻不是必須的。與野生型小鼠相比，caspase-1-/-小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞的發(fā)育情況并沒有明顯的變化[16]。在腫瘤微環(huán)境中，M-MDSCs可以進(jìn)一步分化TAMs[17]。我們的結(jié)果顯示YVAD給藥雖能一定程度減少M(fèi)-MDSCs的比例(CD11b+Gr-1+SSClow)，但是TAMs比例卻沒有明顯的改變，并且在體外YVAD給藥不能抑制單核-巨噬細(xì)胞分化的過程。這表明caspase-1不能調(diào)控M-MDSCs的分化為TAMs的過程。Youn等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在體外還是體內(nèi)M-MDSCs都具有分化為PMN-MDSCs的能力，而這可能是caspase-1調(diào)控MDSCs細(xì)胞發(fā)育的機(jī)制所在。

caspase-1對(duì)于腫瘤的調(diào)控具有兩面性[15]。一方面，caspase-1通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡或激活機(jī)體的獲得性免疫而抑制腫瘤生長(zhǎng);另一方面caspase-1介導(dǎo)IL-1β的釋放能通過促進(jìn)MDSCs的擴(kuò)增和活化而促進(jìn)腫瘤發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)基于移植性原位乳腺癌小鼠模型，探討了caspase-1對(duì)于腫瘤微環(huán)境中 MDSCs和 TAMs細(xì)胞發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)caspase-1可以調(diào)控PMN-MDSCs的發(fā)育，從而間接影響腫瘤的發(fā)展。這些結(jié)果不僅拓展了我們對(duì)于caspase-1相關(guān)生理和病理學(xué)功能的認(rèn)識(shí)，而且還為以caspase-1為靶點(diǎn)研發(fā)腫瘤治療藥物的探索提供了理論依據(jù)。

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