王志旺 孫少伯 程小麗 王永輝 任 遠(yuǎn) 王瑞瓊 藺興遙 李應(yīng)東

(甘肅中醫(yī)學(xué)院/甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730000)

中藥當(dāng)歸為傘形科植物，當(dāng)歸Angelica Sinensis(oliv.)Diels干燥根，有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便的功能，主治血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、腸燥便秘等癥，自古一直被中醫(yī)廣泛用于多種疾病的治療，素有“十方九歸”之稱。當(dāng)歸治療哮喘自古就有記載，《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》、《本草圖經(jīng)》以及《慎齋醫(yī)書(shū)》等著作中都有當(dāng)歸治療哮喘的理論與臨床應(yīng)用，如《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載當(dāng)歸“為補(bǔ)血活血要藥，故主咳逆上氣也”。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)豚鼠離體痙攣狀態(tài)氣管平滑肌有明顯的解痙作用[1]，本次研究以哮喘大鼠行為學(xué)、肺組織淋巴細(xì)胞T盒(T-bet)和GATA結(jié)合蛋白3(GATA-3)蛋白表達(dá)水平以及肺組織病理學(xué)等為研究指標(biāo)，探討當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠的平喘作用，為當(dāng)歸以及當(dāng)歸揮發(fā)油的平喘、治療支氣管哮喘提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SD大鼠，雌性，體質(zhì)量115～145 g，SPF級(jí)，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(甘)2004-0006。甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，普通飲食及飲水。超臨界CO2萃取當(dāng)歸揮發(fā)油，甘肅省岷縣康達(dá)藥業(yè)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司提供;醋酸地塞米松片，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H33020822，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào):111068;卵清白蛋白(OVA)，Grade V，Sigma公司產(chǎn)品;吐溫-80，上海大眾制藥廠，生產(chǎn)批號(hào):70093;抗體T-bet、抗體GATA-3購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用0.8%吐溫-80配制當(dāng)歸揮發(fā)油(1.6%、0.8%、0.4%)與地塞米松(0.005%)乳狀液，另配制0.8%吐溫-80的空白對(duì)照液，冷藏備用。420AI超聲霧化器，江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司生產(chǎn);TGL-16G高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;722型分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品;BS1103型Sartorius電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司;HH-S型恒溫水浴鍋，金壇市正基儀器有限公司。

1.2 動(dòng)物篩選 將大鼠放于自制的密閉玻璃箱內(nèi)，超聲霧化0.5%磷酸組胺生理鹽水溶液刺激大鼠，觀察大鼠吸入組胺后的呼吸變化情況，選擇吸入組胺后20秒內(nèi)出現(xiàn)呼吸急促、前肢縮抬、點(diǎn)頭或腹式呼吸等哮喘癥狀的大鼠作為實(shí)驗(yàn)用大鼠。

1.3 分組、造模與給藥 取篩選合格雌性大鼠[2]54只，按體重分層隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組(Group A)、模型對(duì)照組(Group B)、地塞米松組(Group C)、當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量組(Group D)、中劑量組(Group E)及低劑量組(Group F)，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食去OVA的特殊飼料和水。致敏時(shí)，除正常對(duì)照組外，各組于第1天、第8天用新鮮配制的OVA 50 mg(5%)與含100 mg(10%)氫氧化鋁凝膠的生理鹽水混懸液共1 ml，在大鼠兩后足跖、兩側(cè)腹股溝做皮下注射，每點(diǎn)0.2 ml，同時(shí)腹腔注射0.2 ml;正常對(duì)照組以生理鹽水代替致敏。第15天開(kāi)始激發(fā)，即將大鼠置于特制玻璃容器內(nèi)(40 cm×30 cm×20 cm)，用超聲霧化器以霧化量0.8 ml/min霧化吸入1%OVA的生理鹽水，每次20分鐘，1次/天，連續(xù)28天;正常對(duì)照組以生理鹽水代替激發(fā)。激發(fā)前1小時(shí)，各組大鼠按10 ml/kg灌胃給藥，即當(dāng)歸揮發(fā)油各劑量組 ig當(dāng)歸揮發(fā)油160、80、40 mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照組ig地塞米松0.5 mg/kg，正常對(duì)照組與模型對(duì)照組ig空白對(duì)照液;1次/天，連續(xù)28天。

1.4 指標(biāo)觀測(cè)與方法

1.4.1 支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn) 分別于實(shí)驗(yàn)的第28天和第42天進(jìn)行。用1%OVA激發(fā)液霧化吸入(霧化參數(shù)與激發(fā)相同)20分鐘，觀察15分鐘內(nèi)大鼠的反應(yīng)并記錄評(píng)分，評(píng)分原則參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[3，4]，記錄大鼠打噴嚏次數(shù)、抓鼻次數(shù)與哮喘程度，觀察藥物的平喘作用。具體計(jì)分方法是:大鼠沒(méi)有出現(xiàn)噴嚏計(jì)為0分，出現(xiàn)1～5個(gè)噴嚏計(jì)為1分，出現(xiàn)6～10個(gè)噴嚏計(jì)為2分，噴嚏＞11個(gè)計(jì)為3分;沒(méi)有抓鼻計(jì)為0分;抓鼻1～5個(gè)計(jì)為1分，抓鼻6～10個(gè)計(jì)為2分，抓鼻＞11個(gè)計(jì)為3分;無(wú)喘息癥狀計(jì)為0分，有輕度喘息(躁動(dòng)或靜伏)計(jì)為3分，明顯喘息(呼吸困難，腹式呼吸、呼吸急促呈點(diǎn)頭狀但幅度較小、迅速抬頭做喘息狀)計(jì)為6分，嚴(yán)重喘息(呼吸極度困難，呼吸急促呈點(diǎn)頭狀幅度大頻率高、或反應(yīng)遲鈍)或致死計(jì)為9分。

1.4.2 Western blot測(cè)定肺組織中T-bet與GATA-3的蛋白表達(dá)水平 大鼠最后一次激發(fā)24小時(shí)后，股靜脈采血處死，打開(kāi)胸腔，于固定位置取未經(jīng)灌洗的左肺組織100 mg，加入600 μl裂解液，經(jīng)冰上勻漿、超聲、靜置后4℃離心(15 000 r/min)15分鐘，取上清液用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白并加入等體積的上樣緩沖液(100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷酸鹽，pH值6.8，200 ml/L甘油，0.2 g/L溴酚藍(lán)，20 g/L十二烷基硫酸鈉，200 mmol/L二硫蘇糖醇)，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，分別與小鼠抗大鼠T-bet、GATA-3 mAb(1∶500)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(1∶1 000)室溫孵育2小時(shí)，小鼠抗大鼠βactin mAb(1∶2 000)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(1∶4 000)同樣室溫溫育2小時(shí)。應(yīng)用發(fā)光試劑顯示蛋白條帶，將顯色的X線片經(jīng)圖像分析系統(tǒng)處理，比較 T-bet、GATA-3與 β-actin的相對(duì)吸光度值，進(jìn)行半定量分析。

1.4.3 肺組織病理變化 取大鼠未經(jīng)灌洗的左肺組織，10%甲醛固定，石蠟切片，HE染色，參照文獻(xiàn)[3，4]，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)上皮細(xì)胞脫落程度與肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)行觀察和半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)哮喘大鼠造模過(guò)程中行為學(xué)的影響 見(jiàn)表1。

在哮喘模型復(fù)制過(guò)程中，選擇實(shí)驗(yàn)第28天與第42天，在霧化吸入OVA激發(fā)過(guò)程中及激發(fā)后15分鐘內(nèi)，觀測(cè)大鼠打噴嚏、抓鼻甚至哮喘樣癥狀并計(jì)分。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，有哮喘樣癥狀的大鼠打噴嚏與抓鼻反而不明顯，故在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上對(duì)支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn)中大鼠的行為計(jì)分方法進(jìn)行了修正，細(xì)化了哮喘樣癥狀的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)并加大哮喘評(píng)分分值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠在支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn)中的行為綜合評(píng)分值顯著增加，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);各給藥組大鼠在激發(fā)實(shí)驗(yàn)中的行為綜合評(píng)分值明顯減小，特別是實(shí)驗(yàn)第42天，大鼠的行為綜合評(píng)分顯著減小(P＜0.01)。

2.2 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)哮喘大鼠肺組織中T-bet和GATA-3蛋白表達(dá)水平的影響 見(jiàn)圖1、表2。經(jīng)Western blot法分析顯示，在蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為62 000、50 000和45 000處有表達(dá)條帶，分別是 T-bet、GATA-3與β-actin蛋白表達(dá)(圖1)。經(jīng)半定量分析可知，T-bet蛋白在哮喘模型對(duì)照組大鼠肺組織中低表達(dá)，經(jīng)當(dāng)歸揮發(fā)油治療后，其表達(dá)水平顯著提高(P＜0.01);GATA-3蛋白在模型對(duì)照組大鼠肺組織中高表達(dá)，經(jīng)80～160 mg/kg劑量范圍內(nèi)的當(dāng)歸揮發(fā)油治療后，其表達(dá)水平明顯降低(表2)。

2.3 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠肺組織病理改變的影響 見(jiàn)圖2、表3與表4。如圖2所示，正常對(duì)照組大鼠肺組織經(jīng)HE染色后，在顯微鏡下炎癥性表現(xiàn)不甚明顯(圖2 Group A)，而模型對(duì)照組大鼠肺組織可見(jiàn)明顯的炎癥反應(yīng):支氣管上皮細(xì)胞腫脹、脫落，基底膜增生、變厚，支氣管壁充血、水腫并有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2 Group B);各給藥組亦存在不同程度的上皮細(xì)胞脫落、支氣管壁充血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等表現(xiàn)，但較模型對(duì)照組明顯減輕(圖2 Group C、D、E、F)。同時(shí)，對(duì)大鼠支氣管壁上皮細(xì)胞脫落程度與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，大鼠支氣管壁上皮細(xì)胞脫落程度與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯較重(P＜0.01)，各給藥組上皮細(xì)胞脫落程度與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度有不同程度的減輕，平均級(jí)數(shù)有所下降，其中當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量組與模型對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)哮喘大鼠造模過(guò)程中行為學(xué)的影響(±s)Tab．1 Effect of VOA on asthmatic rat's behaviors under bronchial motivation by OVA(±s)

表1 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)哮喘大鼠造模過(guò)程中行為學(xué)的影響(±s)Tab．1 Effect of VOA on asthmatic rat's behaviors under bronchial motivation by OVA(±s)

Note:Compared with group B(model group)，1)P＜0.01，2)P＜0.05.

Score Group A - 9 2.3±1.81) 9 2.8±0.41)Groups Dose(mg/kg)28 d 42 d n Score n Group B - 9 8.2±2.4 9 9.9±3.0 Group C 0.5 9 1.9±1.11)8 1.9±0.41)Group D 160 9 4.2±2.21)9 4.6±0.91)Group E 80 9 5.0±2.12)9 5.8±1.81)Group F 40 9 5.3±2.62)9 5.6±1.91)

圖1 大鼠肺組織中T-bet、GATA-3與相應(yīng)β-actin蛋白表達(dá)的Western blot分析Fig．1 Analysis expression of T-bet，GATA-3 and their β-actins of lung tissue of the asthma in rats

表2 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)哮喘大鼠肺組織中T-bet和GATA-3蛋白表達(dá)水平的影響Tab．2 Effect of VOA on expression of T-bet，GATA-3 and their β-actins of lung tissue of the asthma in rats

圖2 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠肺臟病理的影響(HE染色;×20)Fig．2 Effect of VOA on lung tissue histological changes of the experimental asthma in rats(HE staining;×20)

表3 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠支氣管壁上皮細(xì)胞脫落程度的影響(±s)Tab．3 Effect of VOA on shedding epithelial cell of bronchus wall of the experimental asthma in rats(±s)

表3 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠支氣管壁上皮細(xì)胞脫落程度的影響(±s)Tab．3 Effect of VOA on shedding epithelial cell of bronchus wall of the experimental asthma in rats(±s)

Note:Compared with group B(model group)，1)P＜0.01，2)P＜0.05.

Groups Dose(mg/kg) n Shedding epithelial cell-(0) +(1) ++(2) +++(3)Average series R Value(95%Confidence interval)Group A - 9 7 2 0 0 0.22 0.09±0.191)Group B - 9 0 0 5 4 2.44 0.79±0.19 Group C 0.5 8 0 5 3 0 1.38 0.41±0.202)Group D 160 9 0 5 4 0 1.44 0.44±0.192)Group E 80 9 0 3 5 1 1.78 0.56±0.19 Group F 40 9 0 2 5 2 2.00 0.63±0.19

表4 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度的影響(±s)Tab．4 Effect of VOA on inflammatory cell of bronchus wall of the experimental asthma in rats(±s)

表4 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度的影響(±s)Tab．4 Effect of VOA on inflammatory cell of bronchus wall of the experimental asthma in rats(±s)

Note:Compared with group B(model group)，1)P＜0.01，2)P＜0.05.

Groups Dose(mg/kg) n Inflammatory cell of bronchus wall-(0) +(1) ++(2) +++(3)Average series R Value(95%Confidence interval)Group A - 9 8 1 0 0 0.11 0.07±0.191)Group B - 9 0 0 6 3 2.33 0.78±0.19 Group C 0.5 8 0 6 2 0 1.25 0.38±0.202)Group D 160 9 0 5 4 0 1.44 0.46±0.192)Group E 80 9 0 4 4 1 1.67 0.54±0.19 Group F 40 9 0 2 6 1 1.89 0.63±0.19

3 討論

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是呼吸系統(tǒng)的常見(jiàn)病、多發(fā)病，是一種由T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥性疾病。近二十年來(lái)盡管已經(jīng)采取包括吸入糖皮質(zhì)激素在內(nèi)的綜合抗炎治療方案，但流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)哮喘的發(fā)病率、死亡率并沒(méi)有隨之而降低[5]，仍然迫切需要去尋找新的方法來(lái)防治哮喘。當(dāng)歸是常用中藥之一，傳統(tǒng)理論認(rèn)為當(dāng)歸和血、行血、補(bǔ)血，“和血而降氣、暢血而行氣”，“故主咳逆上氣”。當(dāng)歸主要含有揮發(fā)油和水溶性成分，其中揮發(fā)油被認(rèn)為是治療哮喘的主要有效部位，臨床研究顯示，用當(dāng)歸揮發(fā)油丸治療哮喘24例，總有效率可達(dá)90.2%[6];以當(dāng)歸揮發(fā)油為主要有效成分的當(dāng)歸喘痛寧治療喘息型支氣管炎及支氣管哮喘61例，有效率為81.2%[7]。豚鼠離體氣管平滑肌實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)歸揮發(fā)油及其中所含中性非酚性部位能舒張豚鼠離體氣管平滑肌，可對(duì)抗Hist、Ach所致豚鼠離體氣管平滑肌的痙攣性收縮作用[1]。本課題組在當(dāng)歸“主咳逆上氣”治療支氣管哮喘的傳統(tǒng)理論與臨床應(yīng)用的指導(dǎo)下，在當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)豚鼠離體氣管解痙有效的前期研究的基礎(chǔ)上，采用OVA與氫氧化鋁致敏、OVA霧化吸入激發(fā)來(lái)復(fù)制哮喘動(dòng)物模型，觀察當(dāng)歸揮發(fā)油平喘、治療支氣管哮喘的作用及其機(jī)制。在OVA霧化致敏過(guò)程中，觀察大鼠打噴嚏、抓鼻甚至哮喘樣癥狀并進(jìn)行計(jì)分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)歸揮發(fā)油能明顯減少大鼠在激發(fā)過(guò)程中的行為綜合評(píng)分;肺組織病理顯示，當(dāng)歸揮發(fā)油可減輕支氣管上皮細(xì)胞脫落、支氣管壁充血水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等表現(xiàn)，對(duì)支氣管壁上皮細(xì)胞脫落程度與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)行半定量分析，當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量組可明顯減輕上述病理指標(biāo)。

1986 年，Mosmann[8]根據(jù)分泌細(xì)胞因子譜及其功能的不同，將CD4+T細(xì)胞分為T(mén)h1和Th2兩種亞群，近30年來(lái)，該分類(lèi)方法形成了理解CD4+T免疫作用機(jī)制的框架，也形成了哮喘發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制，即以Th2占優(yōu)勢(shì)的Th1與Th2細(xì)胞及其相關(guān)因子的免疫失衡是哮喘的主要原因[9]。轉(zhuǎn)錄因子淋巴細(xì)胞T盒(T-bet)與GATA結(jié)合蛋白3(GATA-3)是Th1與Th2細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在Th細(xì)胞的分化中發(fā)揮重要調(diào)控作用。T-bet是Th1細(xì)胞發(fā)育的主要開(kāi)關(guān)，通過(guò)IFN-γ-STAT1(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子1)信號(hào)使其表達(dá)增加，活化的T-bet能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量IFN-γ等Th1類(lèi)細(xì)胞因子而抑制Th2類(lèi)細(xì)胞因子的產(chǎn)生;GATA-3僅在Th2細(xì)胞中表達(dá)，通過(guò)IL-4/STAT6信號(hào)使GATA-3表達(dá)增加，活化的GATA-3進(jìn)入胞核，上調(diào)Th2類(lèi)細(xì)胞因子表達(dá)，從而促進(jìn)Th2分化，抑制Th1分化。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)歸揮發(fā)油可明顯促進(jìn)肺組織T-bet的表達(dá)而抑制GATA-3的表達(dá)，調(diào)節(jié)T-bet/GATA-3免疫平衡，這也是當(dāng)歸揮發(fā)油平喘的作用機(jī)制之一。

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