印雙紅 陳小林 徐芳潔 張旭勇 吳向未 侯 雋 陳雪玲

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，石河子832002)

包蟲病(Hydatid disease)又稱棘球蚴病，是棘球蚴寄生于中間宿主引起的一種嚴(yán)重影響人畜健康的寄生蟲疾病。包蟲病在手術(shù)治療過程中或者在正?；颊唧w內(nèi)，由于包囊意外破裂，部分原頭節(jié)可能進(jìn)入組織內(nèi)，造成再次感染，也給包蟲病的治療帶來很大困難[1]。蟲體之所以能在宿主體內(nèi)長期生存，有賴于對(duì)宿主的免疫逃避功能。目前關(guān)于蟲體免疫逃逸的研究主要是Th1/Th2的漂移可能產(chǎn)生的免疫逃避[2]。對(duì)于NK細(xì)胞(Natural killer cell)在包蟲免疫逃逸中的作用，有臨床研究顯示其NK細(xì)胞活性明顯下降，目前實(shí)驗(yàn)研究的資料較少[3]。本文主要探討細(xì)粒棘球蚴感染小鼠后，對(duì)小鼠NK細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雌性BALB/c小鼠，6～8周，購自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 流式抗體Anti-Mouse CD49b-FITC(DX-5)、Anti-Mouse CD314-PE(NKG2D)購自 eBioscience公司;流式細(xì)胞儀(FACS AriaⅢ)購自BD公司;小鼠淋巴細(xì)胞分離液購自Solarbio;Yac-1細(xì)胞購自上海銳聰科技;酶標(biāo)儀購自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的制備 從感染細(xì)粒棘球蚴病的羊肝上，無菌抽取無鈣化、無感染、完整的單囊型細(xì)粒棘球蚴包囊內(nèi)容物，置于無菌離心管內(nèi)，原頭節(jié)(Protoscole，PSC)自然沉淀，再用含有100 U/ml青霉素和鏈霉素雙抗的無菌PBS(pH7.3)漂洗3次，除去育囊碎片使其自然沉淀，經(jīng)0.5%伊紅染色5分鐘，在顯微鏡下鑒定具有活性的蟲體數(shù)(＞90%)，用含雙抗的無菌 PBS稀釋制成含有原頭節(jié)10 000個(gè)/ml的原頭節(jié)懸液，備用。

1.2.2 建立細(xì)粒棘球蚴感染小鼠動(dòng)物模型 將60只健康BALB/c小鼠，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組:腹腔接種濃度為10 000個(gè)/ml原頭節(jié)，加入100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素0.2 ml/只;對(duì)照組:腹腔接種PBS加入100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素0.2 ml/只，分別在1、3、5、7、9、12 天的時(shí)候頸椎脫臼法處死小鼠，無菌摘取脾臟，制備脾細(xì)胞懸液。

1.2.3 小鼠脾臟細(xì)胞分離 脫頸處死小鼠，無菌摘取小鼠脾臟，用1支5 ml和1支1 ml注射器在含有少許PBS的小平皿中刮出脾細(xì)胞。用1 ml注射器抽吸刮出的脾細(xì)胞3～5次，使脾細(xì)胞盡量分散。向一新離心管加入3 ml的小鼠淋巴細(xì)胞分離液，再將約1.5 ml的脾細(xì)胞懸液緩慢加入(V分離液∶V脾細(xì)胞懸液=2∶1)，2 000 r/min離心20分鐘。取出中間的云絮層(淋巴細(xì)胞層)用3 ml PBS，1 000 r/min離心5分鐘洗滌2～3次。最后將沉淀細(xì)胞懸浮于1 ml 1640液中。細(xì)胞計(jì)數(shù)，配成(2～3)×107ml-1備用。

1.2.4 LDH法檢測(cè)NK的殺傷活性 取效應(yīng)細(xì)胞淋巴細(xì)胞1×107個(gè)/ml和靶細(xì)胞Yac-1 cells 1×105個(gè)/ml各0.1 ml(E∶T=100∶1)加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)3復(fù)孔，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放孔(0.1 ml靶細(xì)胞+0.1 ml 10%FCS-RPMI1640培養(yǎng)液)和最大釋放孔(0.1 ml靶細(xì)胞+0.1 ml 1%NP40液)，1 000 r/min低速離心2分鐘。置37℃，5%CO2孵育2小時(shí)。1 000r/min離心5分鐘。吸取各孔上清0.1 ml加至新96孔板中，37℃，10分鐘。每孔再加入0.1 ml新配制的LDH底物溶液，室溫避光反應(yīng)10～15分鐘。加入30 μl 1 mol/L檸檬酸終止液終止酶促反應(yīng)。酶聯(lián)監(jiān)測(cè)儀在570 nm波長下讀各孔A值。計(jì)算:根據(jù)下列公式計(jì)算NK細(xì)胞活性:NK細(xì)胞活性

1.2.5 流式細(xì)胞染色及檢測(cè) 取1×106個(gè)脾細(xì)胞，向各管中加入小鼠血清孵育15分鐘，再分別加入 Anti-Mouse CD49b-FITC(DX-5)，Anti-Mouse CD314-PE(NKG2D)抗體，4℃下避光孵育30分鐘，進(jìn)行表面染色;PBS洗滌1次，加入0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，用FACS AriaⅢ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組樣本之間用方差分析，兩組間比較采用兩樣本均數(shù)的t參數(shù)檢驗(yàn)或q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠不同時(shí)間，對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響 乳酸脫氫酶法(LDH)檢測(cè)結(jié)果顯示:經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析小鼠腹腔接種細(xì)粒棘球蚴后1、3、5、7、9、12天的NK細(xì)胞對(duì)Yac-1細(xì)胞的裂解率(NK細(xì)胞殺傷活性)與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中在小鼠感染后的1、3、5、9 天，P ＜0.001，見圖1。隨著時(shí)間的推移感染組小鼠NK細(xì)胞的殺傷活性呈下降的趨勢(shì)，經(jīng)q檢驗(yàn)分析，各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1);由第1天的最高值(17.7%±0.561%)到第12天下降至(8.10%±0.745%)，并且低于對(duì)照組(9.25%±0.401%)(如圖2)。

2.2 小鼠細(xì)粒棘球蚴感染早期對(duì)NK細(xì)胞表面激活受體NKG2D表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴感染早期小鼠對(duì)NK細(xì)胞表面激活受體NKG2D的表達(dá)，細(xì)粒棘球蚴感染早期小鼠后，隨著時(shí)間的延長NK細(xì)胞的活性受體NKG2D的表達(dá)量呈下降的趨勢(shì)，第1天最高，且顯著高于對(duì)照組(P＜0.001);第12天最低，明顯低于對(duì)照組(P＜0.001)。與對(duì)照組比較，感染后 1、3、9、12 天NKG2D的表達(dá)量都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.001)(圖3、4)。

圖1 細(xì)粒棘球蚴感染早期小鼠對(duì)NK細(xì)胞活性的影響Fig．1 The influence of spleen NK cytotoxic activity in early Echinococcus granulosus infected BALB/c mice

2.3 小鼠細(xì)粒棘球蚴感染早期對(duì)NK細(xì)胞數(shù)量的影響 通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞上DX-5的表達(dá)情況，了解細(xì)粒棘球蚴感染早期小鼠后對(duì)NK細(xì)胞數(shù)量的影響。結(jié)果顯示，NK細(xì)胞數(shù)量在感染后有所升高，感染后第1天最高達(dá)到7.76%，但隨著時(shí)間的延長NK細(xì)胞數(shù)量呈下降的趨勢(shì)，第5天開始低于感染前，至第12天下降至3.86%最低;經(jīng)q檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與感染前比較，感染后第 1、3、9、12天NK數(shù)量差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1、圖5)。

圖2 LDH法檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴感染早期小鼠不同時(shí)間NK細(xì)胞殺傷活性的變化趨勢(shì)Fig．2 Trends of spleen NK cytotoxic activity analyzed by LDH in early stages of infection

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴感染早期小鼠后NKG2D的表達(dá)Fig．3 The expression of NKG2D on spleen cells were analyzed by flow cytometry in early stages of infection

2.4 相關(guān)性分析 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠早期，通過對(duì)NK細(xì)胞的活性及其活性受體NKG2D的表達(dá)檢測(cè)顯示:隨著感染時(shí)間的延遲，NK細(xì)胞活性受體NKG2D的表達(dá)和NK細(xì)胞殺傷活性均呈下降的趨勢(shì)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，細(xì)粒棘球蚴感染小鼠早期，NK細(xì)胞的殺傷活性與其活性受體NKG2D的表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.679(圖6)。

表1 FCM檢測(cè)E．g感染早期BALB/c小鼠對(duì)NK細(xì)胞數(shù)量的影響(%)Tab．1 The number of changes of CD4+CD25+T cells were detected by FCM in the early of E．g infection in BALB/c mice(%)

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染組小鼠NKG2D在不同時(shí)期NK細(xì)胞表達(dá)的變化趨勢(shì)Fig．4 Trends of the levels of NKG2D on spleen cells analyzed by flow cytometry in early stages of infection

圖5 FCM檢測(cè)E．g感染早期BALB/c小鼠NK細(xì)胞數(shù)量在感染前后的變化Fig．5 Results diagram of the number of NK cells were detected by FCM in the early of E．g infection in BALB/c mice

圖6 NK細(xì)胞殺傷活性與NK細(xì)胞活性受體NKG2D的表達(dá)相關(guān)性分析相關(guān)系數(shù)(r=0．679)Fig．6 Correlation between NK cytotoxic activity and receptor expression(r=0．679)

3 討論

細(xì)粒棘球蚴感染宿主后能夠在宿主體內(nèi)長期存活的機(jī)理雖未完全清楚，NK細(xì)胞作為識(shí)別病原入侵的第一道防線，沒有充分發(fā)揮天然免疫，應(yīng)該是發(fā)病的重要原因之一[4]。

對(duì)于NK細(xì)胞方面的研究，現(xiàn)階段主要集中在泡球蚴(AE)臨床患者的外周血中比例下調(diào)現(xiàn)象的研究。Nicod[3]研究AE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞活性明顯下降，且NK細(xì)胞活性降低與PBMC中NK細(xì)胞比例低有關(guān)。李富榮[5]也通過檢測(cè)患者外周血發(fā)現(xiàn)，AE患者的NK細(xì)胞比例比正常人的降低，同時(shí)張琰等[6]的研究也表明，維吾爾族和漢族包蟲病病例組中NK細(xì)胞比例水平均較健康人組顯著降低，提示包蟲感染后，可能會(huì)抑制NK細(xì)胞的一些免疫功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在小鼠細(xì)粒棘球蚴感染早期中，小鼠NK細(xì)胞及其活性受體NKG2D均呈下降的趨勢(shì)，感染后第1天最高(顯著高于對(duì)照組)，第5天降至對(duì)照組的水平，至第12天時(shí)遠(yuǎn)低于對(duì)照組。這可能是由于細(xì)粒棘球蚴感染后，小鼠NK細(xì)胞數(shù)量及其活性受體NKG2D應(yīng)激性增高，但隨著感染時(shí)間的延遲，又呈下降趨勢(shì)至低于正常水平，而處于抑制狀態(tài)，這與人感染泡球蚴后對(duì)NK細(xì)胞活性的抑制結(jié)果相同[7]。

NKG2D屬H型跨膜蛋白，廣泛分布于人NK細(xì)胞、DC、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞，是NK細(xì)胞表面的活性受體。在小鼠體內(nèi)，NKG2D主要分布于NK細(xì)胞和部分CD8+T細(xì)胞。NKG2D無需抗原呈遞即可直接識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的配體分子，進(jìn)而激活或協(xié)同刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞，從而發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[8]。隨著活化受體 NKG2D及其配體的發(fā)現(xiàn)和研究的深入，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞能夠識(shí)別靶細(xì)胞表面壓力(熱休克、病毒或細(xì)菌感染、惡性轉(zhuǎn)化等)誘導(dǎo)下所表達(dá)的配體而啟動(dòng)活化信號(hào)。這種活化可以不受NK細(xì)胞抑制性信號(hào)的控制，即NKG2D的單獨(dú)活化足以刺激NK細(xì)胞的活化，并能克服抑制性受體的強(qiáng)勢(shì)信號(hào)。這種被稱為“壓力誘導(dǎo)(induced-self)”的識(shí)別模式使NK細(xì)胞能夠及時(shí)識(shí)別各種危險(xiǎn)信號(hào)[9-11]。NK細(xì)胞的殺傷活性與其表面的活性受體NKG2D的表達(dá)量呈正相關(guān)[12]。有研究報(bào)道:HIV病毒的 Nef和 Vif蛋白能部分下調(diào)細(xì)胞表面NKG2DLs，而降低NKG2D受體介導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞(殺傷被感染細(xì)胞)的殺傷能力[13，14]。弓形體能提高NKG2D的表達(dá)和NK細(xì)胞的活性，導(dǎo)致懷孕女性和孕鼠妊娠異常[11]。Nicod[3]研究 AE 患者發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞活性明顯下降;此后，又發(fā)現(xiàn)AE也能夠通過 MICA/B和 TGF-β的持續(xù)表達(dá)而抑制了NKG2D的表達(dá)，然后改變宿主免疫，利于多房棘球絳蟲的侵入[7]。在細(xì)粒棘球蚴感染的研究中我們也得到相似結(jié)果:我們通過對(duì)小鼠感染細(xì)粒棘球蚴早期(感染后1～12天)，觀察NK細(xì)胞數(shù)量，NK細(xì)胞的殺傷活性及其表面的活性受體NKG2D的表達(dá)量。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延遲，NK細(xì)胞數(shù)量和NK細(xì)胞殺傷活性下降，NKG2D表達(dá)量也降低，NK細(xì)胞殺傷活性下降與NKG2D呈正相關(guān)，使得棘球蚴逃避宿主的免疫應(yīng)答，而能在宿主體內(nèi)長期生存。

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