陳育民 陳曉潔 劉曉霞 王雪玲 陳雪皎 (河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，邯鄲056029)

惡性腫瘤是危害人類健康和生命的嚴(yán)重疾病之一。目前，化學(xué)治療是腫瘤治療中必不可少的手段之一，但單純化療常引起免疫抑制，導(dǎo)致惡性反復(fù)感染，機(jī)體衰弱，時常出現(xiàn)各種不同程度的毒副反應(yīng)、預(yù)后不良而加速患者的死亡。環(huán)磷酰胺(CTX)作為臨床常用的化療藥物，對免疫系統(tǒng)有抑制作用，T細(xì)胞也在被抑制之列，而T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是抗腫瘤的主力[1]，故化療后腫瘤患者的抗腫瘤能力降低，無法自我徹底清除體內(nèi)殘存的腫瘤細(xì)胞，使其應(yīng)用受到一定的限制。因此，尋找能夠逆轉(zhuǎn)化療對T細(xì)胞抑制的藥物，將有助于臨床上更好開展化療治療腫瘤。

八珍湯源自《正體類要》，是四君子湯和四物湯的復(fù)方。四君子湯能健脾益氣，四物湯可補(bǔ)血養(yǎng)血，八珍湯能匯兩方之功，奏兩方之效，為氣血雙補(bǔ)的經(jīng)典方。臨床上常用于內(nèi)科、婦科上的病后失調(diào)、久病失治、失血過多等慢性消耗性疾病的治療。近年來，中藥日益受到重視，八珍湯作為中國古方的經(jīng)典方，其對免疫系統(tǒng)的藥理作用近年來已有報道，但對化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子的影響還未見報道。故本研究探討了八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞增殖、T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的影響，為臨床上輔助治療腫瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及瘤株 健康昆明小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由河北工程大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。S180腫瘤細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心饋贈。

1.1.2 藥物 八珍湯(一副)包括:當(dāng)歸10 g，川芎5 g，白芍 8 g，甘草 5 g，熟地黃 15 g，人參 3 g，白術(shù)10 g，茯苓8 g。均購自邯鄲市中醫(yī)院中藥房，經(jīng)河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理室鑒定。將所有藥材水中浸泡0.5小時，加入大約為藥材體積10倍的水，煮沸1小時，濾出藥液;再加5倍體積的水，煮沸0.5小時，濾出藥液。兩次藥液合并，水浴蒸發(fā)至終濃度為2 g生藥/ml的藥液。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑 四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、RPMI1640培養(yǎng)基、ConA為美國Sigma公司產(chǎn)品;PE-Cy7-抗小鼠 CD3、FITC-抗小鼠 CD4、PE-抗小鼠CD8均為eBioscience公司產(chǎn)品;小鼠IL-2、IFN-γ ELISA試劑盒為伊萊瑞特生物科技有限公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立、分組及給藥 取腹腔內(nèi)傳代7天的肉瘤S180小鼠，脫臼處死小鼠，在無菌條件下抽取腹腔內(nèi)瘤細(xì)胞，并以生理鹽水洗滌3次，2 500 r/min離心3分鐘，棄上清液，用無菌生理鹽水調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度為5×106ml-1，接種于小鼠右腋窩皮下(0.2 ml/只)。接種24小時后隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為模型組、CTX組、八珍湯+CTX組。另取10只正常小鼠作為正常對照組。正常對照組和模型組腹腔注射生理鹽水0.1 ml/(10 g·d)，連續(xù)3天，CTX組和八珍湯+CTX組腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)0.1 ml/(10 g·d)，連續(xù)3天。自第4天始，正常對照組、模型組和CTX組用生理鹽水0.2 ml/(10 g·d)灌胃，八珍湯+CTX組用八珍湯0.2 ml/(10 g·d)灌胃，連續(xù)10天。末次給藥后2小時進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.2.2 MTT法檢測八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞增殖的影響 處死小鼠，無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)計數(shù)活細(xì)胞在95%以上。用完全RPMI1640培養(yǎng)液將脾細(xì)胞懸液調(diào)配成細(xì)胞濃度2×106ml-1的單細(xì)胞懸液。取已制備的脾細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，100 μl/孔，每個樣本做6個孔。其中3孔加ConA液(0.1 mg/ml)100 μl，使其終濃度為5 μg/ml，另3孔作為對照。置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。于實(shí)驗(yàn)終止前每孔加入5 g/L MTT 20 μl，振蕩器上振蕩10分鐘，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入100 μl DMSO，振蕩10分鐘，使紫色結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀于570 nm波長測定A值。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組平均A值 /對照組平均A值)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群的影響 取100 μl已制備的脾淋巴細(xì)胞懸液于EP管中，4℃、1 500 r/min離心5分鐘，加入冷 PBS 1 ml，離心，棄上清，加冷凍 PBS 100 μl，并按說明加入 PE-Cy7-抗小鼠 CD3、FITC-抗小鼠 CD4、PE-抗小鼠 CD8，4℃避光孵育30分鐘，加入 PBS1 ml，離心，棄上清，加入 500 μl PBS，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 ELISA檢測八珍湯對化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影響 末次給藥后2小時，各組小鼠球后靜脈叢采血，每只取血0.8～1 ml，分離血清，并嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個復(fù)孔。將每個標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)本的OD值減去空白孔的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，以平滑曲線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)，通過標(biāo)本的OD值在曲線上查出其對應(yīng)濃度。IL-2/IFN-γ(μg/L)=標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的濃度×稀釋倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.5軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以±s表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞增殖的影響

用MTT法檢測各組T細(xì)胞經(jīng)ConA刺激72小時后的增殖能力，由圖1可見各組荷瘤小鼠的T細(xì)胞增殖能力顯著低于正常對照組(P＜0.01)，CTX組T細(xì)胞增殖能力明顯低于模型組(P＜0.01)，八珍湯+CTX組T細(xì)胞增殖能力明顯高于CTX組(P＜0.01)，與模型組相比沒有顯著性差異，但有增高趨勢(P＞0.05)。

表1 八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群的影響(±s，%)Tab．1 Effect of bazhen decoction on subpopulations of T lymphocytes in tumor-bearing mice after chemotherapy(±s，%)

表1 八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群的影響(±s，%)Tab．1 Effect of bazhen decoction on subpopulations of T lymphocytes in tumor-bearing mice after chemotherapy(±s，%)

Note:Compared with normal control group，1)P ＜0.01;compared with model group，2)P ＜0.01;compared with model group，3)P ＜0.05;compared with CTX group，4)P ＜0.01.

7±4.29 1.59±5.06 Model 10 40.21±4.711) 23.89±6.321) 12.51±3.651) 1.82±3.271)CTX 10 24.26±7.281)2) 15.60±4.931)2) 7.46±3.011)2) 1.92±2.351)Bazhen decoction+CTX 10 34.93±4.241)3)4) 19.46±5.041)3)4) 10.48±4.841)3)4) 1.79±4.831)CD4/CD8 Normal control 10 47.43±7.08 28.25±3.12 17.1 Groups n CD3+T CD3+CD4+T CD3+CD8+T

圖1 八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞增殖能力的影響Fig．1 Effect of Bazhen decottion on proliferation of T lymphocytes in tumor-bearing mice after chemotherapy

2.2 八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群的影響由表1可見，各荷瘤小鼠組的T細(xì)胞亞群明顯低于正常對照組(P＜0.01)，而CD4/CD8比值明顯高于正常對照組(P＜0.01)。CTX組的T細(xì)胞亞群與模型組相比顯著降低(P＜0.01)。八珍湯+CTX組的T細(xì)胞亞群明顯高于CTX組(P＜0.01)，但仍低于模型組(P＜0.05)。各荷瘤小鼠組CD4/CD8比值均無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 八珍湯對化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影響 ELISA測得各組小鼠血清細(xì)胞因子的結(jié)果如表2所示:各荷瘤小鼠組血清中IFN-γ、IL-2的含量明顯低于正常對照組(P＜0.01)，CTX組荷瘤小鼠血清中 IFN-γ、IL-2含量明顯低于模型組(P＜0.01)，八珍湯+CTX組小鼠血清IFN-γ、IL-2含量明顯高于CTX組(P＜0.01)，而與模型組無顯著性差異(P＞0.05)。

表2 八珍湯對化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影響(μg/L，±s)Tab．2 Effect of Bazhen decoction on serum levels of TFN-γ and IL-2 in tumor-bearing mice after chemotherapy(μg/L，±s)

表2 八珍湯對化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影響(μg/L，±s)Tab．2 Effect of Bazhen decoction on serum levels of TFN-γ and IL-2 in tumor-bearing mice after chemotherapy(μg/L，±s)

Note:Compared with normal control group，1)P ＜0.01;compared with model group，2)P ＜0.01;compared with CTX group，3)P＜0.01.

Groups n IFN-γIL-2 Normal control 10 10.276±6.953 9.841±2.618 Model 10 7.702±7.0161) 6.914±3.9081)CTX 10 4.260±3.5621)2) 4.012 1±5.2831)2)Bazhen decoction+CTX 10 7.329±3.7081)3) 7.025±2.9671)3)

3 討論

腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，目前除手術(shù)外，化學(xué)療法是治療腫瘤的主要手段，但它在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時，也會殺傷正常細(xì)胞，對機(jī)體的免疫功能全面抑制，使機(jī)體免疫功能低下。而T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能低下在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。故機(jī)體T細(xì)胞的狀況能夠反映機(jī)體抗腫瘤的能力。因此如何提高化療后機(jī)體T細(xì)胞功能是腫瘤治療的一個重要內(nèi)容。

國內(nèi)已將中草藥用于防治化療毒副作用方面[2-4]。八珍湯源自《正體類要》，是四君子湯和四物湯的復(fù)方。四君子湯能健脾益氣，四物湯可補(bǔ)血養(yǎng)血，八珍湯能匯兩方之功，奏兩方之效，為氣血雙補(bǔ)的經(jīng)典方。臨床上常用于內(nèi)科、婦科上的病后失調(diào)、久病失治、失血過多等慢性消耗性疾病的治療。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)八珍湯能夠解除TGF-β1對T細(xì)胞增殖和活化的抑制作用[5]。本文從下述指標(biāo)觀察了八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞及細(xì)胞因子的影響。

在體外研究中，T細(xì)胞經(jīng)特異性抗原或非特異性抗原，如ConA等的誘導(dǎo)，會發(fā)生轉(zhuǎn)化增殖。因此，常將T細(xì)胞的增殖反應(yīng)作為評價T細(xì)胞功能，反映機(jī)體免疫狀況的指標(biāo)[6]。T細(xì)胞按表面CD分子的不同分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，參與抗腫瘤免疫的主要是CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，故T細(xì)胞亞群是反映機(jī)體抗腫瘤能力的一個常用指標(biāo)。IFN-γ是活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多潛能的細(xì)胞因子，對免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，它可以激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)MHC分子表達(dá)和抗原提呈，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞分化，從而促進(jìn)細(xì)胞免疫功能[7]。IL-2主要由活化的細(xì)胞產(chǎn)生，是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能最主要的細(xì)胞因子之一。它能刺激T細(xì)胞的生長和分化，激活NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，促進(jìn)CTL細(xì)胞的功能。故IFN-γ和IL-2不僅能反映T細(xì)胞的功能，而且在一定程度上也能反映機(jī)體的免疫水平，在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:八珍湯能夠促進(jìn)T細(xì)胞增殖，提高CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例，特別是CD8+T細(xì)胞比例，促進(jìn)T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2。故可知八珍湯可促進(jìn)T細(xì)胞功能，提高機(jī)體細(xì)胞免疫能力。

因此，本研究為臨床上將八珍湯用于改善化療所致機(jī)體免疫功能低下提供了理論依據(jù)。但有關(guān)八珍湯的給藥時間、用藥時間長短等問題需要進(jìn)一步探討。

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3 古紅莉.參麥注射液減輕惡性腫瘤化療毒副作用60例臨床觀察[J].新中醫(yī)，2008;40(10):20-21.

4 邵青偉，葛 熙.參芪扶正液預(yù)防癌癥化療所致毒副作用的觀察與護(hù)理[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2010;14(10):17-18.

5 劉曉霞，陳劍華，陳育民et al.八珍湯對TGF-β1抑制的T淋巴細(xì)胞增殖及其活化影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2009;25(11):1053-1055.

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7 金伯泉.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008;60-61.

8 金伯泉.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008;252-253.