陳文波，李衛(wèi)國(guó)，張 珍，焦春磊，吳 帆

(河南理工大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，河南焦作 454000）

胰蛋白酶Trypsin(EC3.4.21.4)是絲氨酸蛋白酶家族的重要成員，是動(dòng)物消化蛋白質(zhì)的重要酶類［1］。胰蛋白酶以非活性酶原的形式被合成和分泌，被腸激酶或者激活的胰蛋白酶切割除去氨基端的酸性激活肽，繼而轉(zhuǎn)變成有活性的胰蛋白酶［2］。胰蛋白酶是一種肽鏈內(nèi)切酶，主要裂解堿性氨基酸Arg或Lys羧基側(cè)鏈肽。激活后的胰蛋白酶不僅可以激活胰蛋白酶原，而且還可以激活胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶原以及羧肽酶原等［3－5］。

目前研究認(rèn)為，胰蛋白酶主要來源于魚類的肝胰臟、腸道和幽門盲囊，在魚類消化、生長(zhǎng)速率和仔魚的成活率方面都有著重要的作用。截至到目前，已在一些魚類中也克隆得到了胰蛋白酶原的cDNA序列，如大西洋鱈魚Gadus morhua［6］、牙鲆Paralichthys olivaceus［7］、藍(lán)鱈魚 Paranotothenia magellanica［8］、日本鰻 鱺 Anguilla japonica［9］、冬鰈Pseudopleuronectes americanus［10］、塞內(nèi)加爾鰨 Solea senegalensis［11］、金頭鯛Sparus aurata［12］、 草 魚Ctenopharyngodon idellus［1］、翹嘴鲌 Culter alburnus［1］等。根據(jù)等電點(diǎn)的不同，目前把硬骨魚類胰蛋白酶原主要分成了兩種類型，分別為陰離子型胰蛋白酶原和陽(yáng)離子型胰蛋白酶原，另外還有一種特殊的類型，主要是與極端環(huán)境相關(guān)［14］。同時(shí)，在一些海水魚類中已發(fā)現(xiàn)多個(gè)編碼胰蛋白酶原的基因，且分屬于不同的胰蛋白酶類型，并展示了不同的組織和發(fā)育表達(dá)模式，提示這些胰蛋白酶的功能差異［6－7，10－11］。

目前在淡水魚類中對(duì)胰蛋白酶的研究相對(duì)較少，僅在草魚和翹嘴鲌中獲得了其cDNA序列，且只報(bào)道了一種基因［1］。是否在淡水魚類中也含有多個(gè)編碼胰蛋白酶原的基因還需要進(jìn)一步研究。本文以模式生物斑馬魚Danio rerio為研究對(duì)象，利用RT-PCR和RACE技術(shù)獲得了3種斑馬魚胰蛋白酶原cDNA序列及氨基酸序列，并對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)特征、同源性和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析。同時(shí)，利用RT-PCR檢測(cè)了三者的組織表達(dá)模式。這些結(jié)果將為深入研究斑馬魚以及脊椎動(dòng)物胰蛋白酶原基因的進(jìn)化和生理功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚和樣品

實(shí)驗(yàn)用健康成年野生型斑馬魚購(gòu)自花鳥魚市場(chǎng)。用曝氣除氯的自來水飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室的魚缸中，用加熱棒控制水溫在24℃，控制晝夜時(shí)間比為14 h:10 h。取樣時(shí)，先冰上麻醉斑馬魚，然后小心取出適量用于基因克隆和組織表達(dá)所需樣品。樣品立即置入預(yù)冷的含有1.0 mL Trizol的離心管中進(jìn)行總RNA提取。所用各種試劑、消耗品和容器均用DEPC處理，解剖器具和玻璃器皿經(jīng)180℃烘烤3 h，以滅活RNA酶。

1.2 試劑

Trizol Reagent購(gòu)自 Invitrogen(USA)公司;E.Z.N.A膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品;Taq DNA Polymerase、DNase I購(gòu)自 Fermentas(USA)公司;ReverTra Ace-α First-strand cDNA Synthesis Kit為Toyobo(Japan)公司產(chǎn)品。PCR所用引物和DNA測(cè)序均由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成;其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 斑馬魚胰蛋白酶原基因的克隆

用Trizol法提取斑馬魚肝臟總RNA，260 nm下的吸光值衡量RNA的濃度，然后用w=0.8%瓊脂糖凝膠，通過28S和18S條帶的亮度來判斷總RNA完整性。按照ReverTra Ace-α First-strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

對(duì)NCBI GenBank中已登錄的魚類胰蛋白酶原cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物(TryF1和TryR1)進(jìn)行斑馬魚胰蛋白酶原基因的克隆。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min，然后94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。根據(jù)所獲得中間片度序列設(shè)計(jì)特異引物，結(jié)合RACE試劑盒接頭引物AAP和 AUAP，進(jìn)行3'-RACE和5'-RACE擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物在w=1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離DNA片段，并在紫外光下回收目的條帶，用E.Z.N.A膠回收試劑盒純化目的產(chǎn)物并進(jìn)行測(cè)序。

表1 用于斑馬魚胰蛋白酶原基因cDNA克隆和RT-PCR所需引物Table 1 Primers used for zebrafish trypsinogens gene cloning and expression analysis

1.4 序列分析

用DNAtools 6.0對(duì)開放閱讀框進(jìn)行分析并翻譯成蛋白質(zhì);利用 SignalP 3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/service/SignalP)進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè);采用Clustalx 1.83軟件對(duì)多個(gè)物種胰蛋白酶原氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并用DNAstar軟件對(duì)各序列的同源性進(jìn)行計(jì)算;運(yùn)用Mega 3.1軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建脊椎動(dòng)物胰蛋白酶原蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 斑馬魚3種胰蛋白酶原基因的組織表達(dá)分析

提取腦、肝臟、心臟、肌肉、卵巢、脾臟和腸組織的總RNA，經(jīng)DNase I處理后，按照ReverTra Ace-α First-strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書，用1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增前，分別對(duì)退火溫度和循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。PCR反應(yīng)體系為20 μL，PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸2 min。同時(shí)，以18S rRNA為內(nèi)參，PCR程序同上，循環(huán)數(shù)改為30。PCR反應(yīng)結(jié)束后，分別取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行w=1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用AlphaImager EP(Alpha Innotech，USA)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳圖像進(jìn)行拍照和分析。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚胰蛋白酶原cDNA克隆

以斑馬魚肝臟總RNA為模版，首先進(jìn)行斑馬魚胰蛋白酶原基因保守區(qū)域的克隆，得到一條428 bp的DNA片段，通過測(cè)序我們得到兩條相似的序列。然后針對(duì)這兩個(gè)序列的差異設(shè)計(jì)特異性引物分別進(jìn)行3'-RACE和5'-RACE擴(kuò)增。把各得到3個(gè)序列進(jìn)行拼接得到兩條斑馬魚胰蛋白酶原cDNA全長(zhǎng)序列，分別命名為zftry1a和zftry1b。zftry1a cDNA全長(zhǎng)891 bp，包含一段編碼242個(gè)氨基酸殘基的729 bp開放讀碼框 (ORF)，一段53 bp的5'非編碼區(qū) (5'-UTR)和一段109 bp的3'-UTR(Gen-Bank登錄號(hào):JQ999996)。zftry1b cDNA全長(zhǎng)858 bp，其中包含一段編碼242個(gè)氨基酸殘基的729 bp ORF，一段36 bp的5'-UTR和一段93 bp的3'-UTR(GenBank登錄號(hào):JQ999997)。

以人胰蛋白酶原基因和zftry1a或zftry1b蛋白序列作為種子序列，選擇tblastn比對(duì)工具在斑馬魚基因組中進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果搜索到一條同源性較高的基因 (ENSDART00000077661)。根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物在斑馬魚肝臟中克隆得到了胰蛋白酶原2(zftry2)的ORF全長(zhǎng)。zftry2 cDNA ORF全長(zhǎng)744 bp，編碼247個(gè)氨基酸殘基 (GenBank登錄號(hào):JQ999998)。

2.2 斑馬魚3種胰蛋白酶原的基本特征分析

預(yù)測(cè)的 zftry1a和 zftry1b相對(duì)分子質(zhì)量均26400，等電點(diǎn)PI分別為4.94和4.93，預(yù)測(cè)的信號(hào)肽由15個(gè)氨基酸組成，為 MRSLVFLVLL-GAAFA，激活肽含有5個(gè)氨基酸殘基，為L(zhǎng)DDDK。zftry1a和zftry1b在PH 7.0下帶電荷量分別為－8.608和－6.944。預(yù)測(cè)的zftryp2相對(duì)分子質(zhì)量26500，PI為7.46，15個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽MKAFILLALFAVAYA，激活肽由9個(gè)氨基酸殘基組成，為APLGDDDDK。在PH 7.0下帶電荷量+1.209。

2.3 氨基酸序列比對(duì)和同源性分析

氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn) (圖1)，斑馬魚3種胰蛋白酶原均具有胰蛋白酶原的保守結(jié)構(gòu)特征:胰蛋白酶催化活性必需的高度保守的催化三聯(lián)體氨基酸 (His-57，Asp-102和Ser-195);位于底物結(jié)合口袋底部的Asp-189和口袋開口處的Gly-216、Gly-226;具有構(gòu)成6個(gè)二硫鍵所需的12個(gè)半胱氨酸殘基;決定結(jié)合底物特異性的一個(gè)關(guān)鍵氨基酸Tyr-172;絲氨酸蛋白酶的典型特征序列即位于催化活性部位絲氨酸附近的氨基酸 (Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro)等。

利用MegAlign進(jìn)行同源性分析顯示，zftry1a和zftry1b的同源性高達(dá)96.7%，zftry2與zftry1a和zftry1b的同源性為64.9%。zftry1a和zftry1b與草魚、青鳉、牙鲆、日本鰻鱺和金頭鯛的同源性(77.3%～88.8%)高于 zftry2與它們的同源性(60.7%～67.4%)，而zftry1a和zftry1b與翹嘴鲌、石斑魚和胡瓜魚的同源性 (64.9%～66.9%)低于zftry2與它們的同源性 (78.8%～89.9%)，zftry1a和zftry1b與大西洋鱈魚和紅鰭東方鲀的同源性與zftry2與它們的同源性接近，均低于與上述魚類的同源性 (表2)。

圖1 斑馬魚與其它部分物種的胰蛋白酶原的氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Alignment of the deduced amino acid sequences of zebrafish trypsinogens and some other vertebrate trypsinogens deposited in Gen Bank

表2 斑馬魚3種胰蛋白酶原與其它部分魚類的氨基酸相似度Table 2 Amino acid sequence percent identity of zebrafish trypsinogens campared to several fish

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從GenBank上獲得已知的脊椎動(dòng)物胰蛋白酶原的氨基酸序列經(jīng)ClustalW方法比對(duì)后，利用Mega3.1以鄰位相接 (N-J)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 (圖2)。由圖可以得出魚類胰蛋白酶原分為三支(Group I、II、III)，按照Roach et al(2002)有關(guān)脊椎動(dòng)物胰蛋白酶原的聚類方法［13］，斑馬魚zftry1a和zftry1b位于硬骨魚類group I，屬于陰離子型胰蛋白酶原。斑馬魚zftry2位于group II，屬于陽(yáng)離子型胰蛋白酶原。

2.5 斑馬魚3種胰蛋白酶原基因的組織表達(dá)

圖2 胰蛋白酶原的進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree based upon the alignment of amino acid sequences from a wide range of vertebrates

采用RT-PCR方法，以18S作為內(nèi)參，對(duì)3種胰蛋白酶原基因在成年斑馬魚腦和6個(gè)外周組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如圖所示 (圖3)，3種胰蛋白酶原基因表達(dá)分布基本類似，在腸中的表達(dá)量均顯著高于其他組織，特別是zftry1a和zftry1b。同時(shí)，在脾臟中沒有檢測(cè)到三者基因的表達(dá)。但是，zftry1a和zftry1b不同的是，除在脾臟沒有檢測(cè)到表達(dá)之外，在肌肉中也沒有檢測(cè)到其mRNA分布。

圖3 RT-PCR方法檢測(cè)胰蛋白酶原基因在成年斑馬魚各組織中的表達(dá)Fig.3 RT-PCR analysis of the expression of trypsinogens mRNA in the adult zebrafish tissues.

3 討論

本文利用RT-PCR和RACE技術(shù)，結(jié)合基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，成功克隆得到了編碼斑馬魚3種胰蛋白酶原的cDNA序列，并對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)、同源性和進(jìn)化關(guān)系以及組織表達(dá)進(jìn)行了研究。根據(jù)蛋白質(zhì)序列以及同源性分析主要?dú)w為兩類:zftry1(zftry1a和zftry1b)和zftry2。分析發(fā)現(xiàn)，斑馬魚3種胰蛋白酶原均具有:催化活性必需的高度保守的催化三聯(lián)體氨基酸 (His-57，Asp-102和 Ser-195);位于底物結(jié)合口袋底部的Asp-189和口袋開口處的Gly-216、Gly-226;具有構(gòu)成6個(gè)二硫鍵所需的12個(gè)半胱氨酸殘基;決定結(jié)合底物特異性的一個(gè)關(guān)鍵氨基酸Tyr-172;絲氨酸蛋白酶的典型特征序列即位于催化活性部位絲氨酸附近的氨基酸 (Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro)。功能氨基酸以及基序的一致性表明斑馬魚3種胰蛋白酶原功能的保守性。Hedstrom等［14］研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶所形成的兩個(gè)口袋(S1和S2)對(duì)底物的結(jié)合至關(guān)重要。比對(duì)發(fā)現(xiàn)，斑馬魚3種胰蛋白酶原形成S1口袋的氨基酸組成完全相同，但是組成S2口袋的氨基酸略有差異。這些結(jié)果提示，斑馬魚3種胰蛋白酶可能有不同的底物選擇特異性。

胰蛋白酶原被合成和分泌后，在小腸中存在Ca2+情況下被腸激酶切去激活肽轉(zhuǎn)變成有活性的胰蛋白酶［2］。腸激酶能夠識(shí)別包含一簇陰離子氨基酸殘基的激活肽［15］。在大部分魚類中激活肽包含3個(gè)酸性氨基酸 (D或E)，而在哺乳動(dòng)物中則是連續(xù)4個(gè)天冬氨酸［1］。我們的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，斑馬魚zftry1和zftry2的激活肽長(zhǎng)度和組成氨基酸不同。zftry1a和zftry1b激活肽含有3個(gè)酸性氨基酸殘基簇 (DDD)，而zftry2與哺乳動(dòng)物類似，含有4個(gè)天冬氨酸組成的激活肽。這與我們進(jìn)化分析的結(jié)果相一致，zftry1a和zftry1b歸為group I，屬于陰離子型胰蛋白酶;斑馬魚zftry2位于group II，屬于陽(yáng)離子型胰蛋白酶。這些不同物種的激活肽序列及其組成的差別可能是由于在進(jìn)化過程中選擇性壓力造成的結(jié)果［16］。

目前，在海水魚類冬鰈［10］和塞內(nèi)加爾鰨［11］中分別已克隆得到2和6種編碼胰蛋白酶原的cDNA序列。目前在淡水魚類中還沒有發(fā)現(xiàn)多種胰蛋白酶原基因。本文通過RT-PCR結(jié)合基因組數(shù)據(jù)庫(kù)成功克隆到3種斑馬魚胰蛋白酶原基因。組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，3種胰蛋白酶原基因在腸中表達(dá)量最高，提示其主要具有消化功能。另外，盡管同屬陰離子型，zftry1a和zftry1b的組織表達(dá)分布也略有差異，zftry1a在肌肉有表達(dá)，而zftry1b則無，這表明二者在組織中可能存在功能差異。一個(gè)有意思的結(jié)果是，在腦中均檢測(cè)到了三者的表達(dá)，且zftry2的表達(dá)量要高于zftry1a和zftry1b的表達(dá)量。這與在塞內(nèi)加爾鰨中得到的結(jié)果相一致［11］。盡管6種塞內(nèi)加爾鰨胰蛋白酶原基因 (ssetryp1，ssetryp1a，ssetryp1b， ssetryp1c， ssetryp2， ssetryp3， ssetrypY)在腦中都有表達(dá)，但是以ssetryp2的表達(dá)量為最高，分別是ssetryp1和ssetrypY表達(dá)量的8.7和69.3倍。因?yàn)閦ftry2和ssetryp2同屬陽(yáng)離子性胰蛋白酶，是否陽(yáng)離子型胰蛋白酶在腦中有著特殊的功能還需要進(jìn)一步研究。總之，胰蛋白酶原基因組織表達(dá)的廣泛性以及在同一組織中各基因表達(dá)量的差異表明胰蛋白酶除了扮演主要的消化功能外，在神經(jīng)系統(tǒng)［17］、生殖系統(tǒng)［18］等都具有一定的功能。

一般而言，魚類蛋白質(zhì)消化酶和代謝酶活性越高，其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和利用的能力越強(qiáng)，從而提高其生長(zhǎng)發(fā)育的速度。目前對(duì)胰蛋白酶的研究還主要集中在基本特性分析和基因克隆上，對(duì)相關(guān)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)胰蛋白酶的表達(dá)調(diào)控研究相對(duì)較少。王桂芹等最近研究認(rèn)為飼料能量和維生素B6對(duì)肝臟蛋白酶活性有影響，但是否對(duì)胰蛋白酶的表達(dá)調(diào)控有無影響還未知［19］。要想進(jìn)一步了解斑馬魚3種胰蛋白酶原基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，啟動(dòng)子序列的克隆則是必須的。

總之，本文克隆得到了3種斑馬魚胰蛋白酶原基因。氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析表明，三者在功能上是保守的，且zftry1a和zftry1b屬于陰離子型胰蛋白酶原，zftry2屬于陽(yáng)離子型胰蛋白酶原。RT-PCR結(jié)果顯示，三者的組織表達(dá)模式略有不同，提示它們的功能既有共性又有特異性。

［1］RUAN Guoliang，LI Yang，GAO Zexia，et al.Molecular characterization of trypsinogens and development of trypsinogen gene expression and tryptic activities in grass carp(Ctenopharyngodon idellus)and topmouth culter(Culter alburnus)［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2010，155(1):77 －85.

［2］王鏡巖，朱圣庚，徐長(zhǎng)發(fā).生物化學(xué)［M］.3版.北京:高等教育出版社，2002:405.

［3］CHEN J M，KUKOR Z，LEMARECHAL C，et al.Evolution of trypsinogen activation peptides［J］.Mol Biol Evol，2003，20(11):1767 －1777.

［4］RUST M B.Nutritional physiology［M］//HALVER J E，HARDY R W.Fish nutrition.3rd ed.Amsterdam:Elsevier，2002:367 －452.

［5］RYPNIEWSKI W，PERRAKIS A，VORGIAS C E，et al.Evolutionary divergence and conservation of trypsin［J］.Protein Eng，1994，7(1):57－64.

［6］GUDMUNDSDOTTIR A，GUDMUNDSDOTTIR E，OSKARSSON S，et al.Isolation and characterization of cDNAs from Atlantic cod encoding two different forms of trypsinogen［J］.Eur J Biochem，1993，217(3):1091－1097.

［7］SUZUKI T，SRIVASTAVA A S，KUROKAWA T.cDNA cloning and phylogenetic analysis of pancreatic serine proteases from Japanese flounder，Paralichthys olivaceus［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2002，131(1):63－70.

［8］GENICOT S，RENTIER－DELRUE F，EDWARDS D，et al.Trypsin and trypsinogen from an Antarctic fish:molecular basis of cold adaptation［J］.Biochim Biophys Acta，1996，1298(1):45－57.

［9］KUROKAWA T，SUZUKI T，OHTA H，et al.Expression of pancreatic enzyme genes during the early larval stage of Japanese eel Anguilla japonica［J］.Fish Sci，2002，68(4):736－744.

［10］DOUGLAS S E，GALLANT J W.Isolation of cDNAs for trypsinogen from the winter flounder，Pleuronectes americanus［J］.J Mar Biotechnol，1998，6(4):214 －219.

［11］MANCHADO M，INFANTE C，ASENSIO E，et al.Molecular characterization and gene expression of six trypsinogens in the flatfish Senegalese sole(Solea senegalensis Kaup)during larval development and in tissues［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2008，149(2):334－344.

［12］PSOCHIOU E，SARROPOULOU E，MAMURIS Z，et al.Sequence analysis and tissue expression pattern of Sparus aurata chymotrypsinogens and trypsinogen［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2007，147(3):367－377.

［13］ROACH J C.A clade of trypsins found in cold-adapted fish［J］.Proteins，2002，47(1):31 －44.

［14］HEDSTROM L，SZILAGYI L，RUTTER W J.Converting trypsin to chymotrypsin:the role of surface loops［J］.Science，1992，255(5049):1249－1253.

［15］LOUVARD M N，PUIGSERVER A.On bovine and porcine anionic trypsinogens［J］.Biochim Biophys Acta，1974，371(1):177－185.

［16］ROACH J C，WANG K，GAN L，et al.The molecular evolution of the vertebrate trypsinogens［J］.J Mol Evol，1997，45(6):640－652.

［17］KOSHIKAWA N，HASEGAWA S，NAGASHIMA Y，et al.Expression of trypsin by epithelial cells of various tissues，leukocytes，and neurons in human and mouse［J］.Am J Pathol，1998，153(3):937 －944.

［18］MIURA C，OHTA T，OZAKI Y，et al.Trypsin is a multifunctional factor in spermatogenesis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(49):20972－20977.

［19］王桂芹，李子平，牛小天，等.飼料能量和維生素B6對(duì)烏鱧生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)代謝酶活性的影響［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，50(4):96－99.