梁翠誼，許敬亮，袁振宏，張 宇，徐惠娟，莊新姝，高月淑，2

(1.中國科學(xué)院廣州能源研究所∥中國科學(xué)院可再生能源與天然氣水合物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640;2.中國科學(xué)院研究生院，北京 100039）

目前，全球的纖維素年產(chǎn)量在1000億t以上，是自然界中分布最廣、含量最多的一類可再生性糖類資源。所以，如何充分利用好纖維素資源，已經(jīng)成為世界各國關(guān)注的熱點(diǎn)話題。利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶分解纖維素成為葡萄糖和纖維二糖，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成乙醇和丁醇等生物燃料，被認(rèn)為是一種非常有潛力的纖維素高效利用策略［1］。

β－葡萄糖苷酶 (β－Glucosidase，EC 3.2.1.21)屬于纖維素酶類復(fù)合組分的其中之一，能催化水解芳香基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖［2］，能有效解除纖維素酶解過程中纖維二糖對纖維素酶活性的抑制，是纖維素酶組分中的關(guān)鍵酶類。目前市面上的產(chǎn)纖維素酶木霉菌株中，β－葡萄糖苷酶含量都很低 (黑曲霉除外)，其分泌的纖維素酶中β－葡萄糖苷酶含量還不到1%，遠(yuǎn)達(dá)不到實(shí)際應(yīng)用的水平［3］;再者在反應(yīng)過程中，由于高溫失活作用，β－葡萄糖苷酶活性會(huì)在反應(yīng)過程中逐漸損失掉［4］，可利用的β－葡萄糖苷酶就更少［5］。而對于工業(yè)應(yīng)用來說，酶的熱穩(wěn)定性越高對應(yīng)用越有利［6］，近年來，耐熱 (嗜熱)β－葡萄糖苷酶成為纖維素酶學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［7］。目前對β－葡萄糖苷酶的研究主要集中在酵母、細(xì)菌和霉菌等，而其中對曲霉、康氏木霉的研究最多［8］，但少有高產(chǎn)、嗜溫、耐乙醇的β－葡萄糖苷酶肉座菌產(chǎn)酶菌株報(bào)道。

本研究從武夷山常年堆放腐爛枯枝、爛葉的土壤中分離篩選得到1株高產(chǎn)β－葡萄糖苷酶的肉座菌Hypocrea sp.W63，對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有嗜溫、耐乙醇的特性，并探討了其在汽爆秸稈同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇上的應(yīng)用效果，以期開發(fā)該菌株的潛在用途。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 pNPG(對硝基酚 －β －D－葡萄糖苷)購自Sigma公司，實(shí)驗(yàn)中用到的化學(xué)試劑均為分析純級(jí)。汽爆秸稈由中國科學(xué)院工程研究所提供，其主要組成 (w)為纖維素22.87%;半纖維素11.51%;木質(zhì)素31.50%，其他成分 34.12%;纖維素酶購自和氏璧生物技術(shù)有限公司，其濾紙酶活力為880 U/g。

1.1.2 培養(yǎng)基

1)CMC－剛果紅篩選培養(yǎng)基。

KH2PO40.5 g， (NH4)2SO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，纖維素粉 (微晶纖維，CMC)2.0 g，剛果紅 0.2 g，瓊脂18～20 g，加水補(bǔ)足1 L，pH值自然。

2)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基。

KH2PO40.2 g， (NH4)2SO40.25 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，CaCl20.03 g，稻稈5 g，微量元素液200 μL，加水至 100 mL。

微量元素液配方:CuSO40.1 g，MnSO40.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，CoCl20.1 g，定容至 100 mL

3)同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基。

500 mL搖瓶中裝反應(yīng)液200 mL，氣爆秸稈20 g，其中無機(jī)鹽成分為 ((NH4)2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.025 g/L)，酵母膏 1.0 g/L。其余為pH 4.8的Na2HPO4－檸檬酸緩沖液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離 取一定量的土壤，加入裝有100 mL無菌水的搖瓶中，內(nèi)加幾粒玻璃珠，振蕩10～20 min;取2 mL混濁液做梯度稀釋，分別取10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7涂布剛果紅篩選培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基，30℃保溫培養(yǎng)。挑取水解透明圈較大的單菌落在PDA培養(yǎng)基上純化，純化的菌株進(jìn)行PDA斜面保存。

菌株產(chǎn)β－葡萄糖苷酶活力復(fù)篩:將PDA斜面保存的純化菌株分別接種到等量的復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，120 rpm，培養(yǎng)72 h以上。冷凍離心取上清液粗酶液，分別用標(biāo)準(zhǔn)pNPG法測定各菌株產(chǎn)的β－葡萄糖苷酶粗酶活力。

1.2.2 菌株鑒定 采用改良CTAB法提取菌株總DNA，選擇擴(kuò)增真菌18S rDNA序列的通用引物NS1(5'－GTATCATATGCTTGTCTC－3')和NS8(5'－TCCGCAGGTTCACCTACGGA－3')對總DNA進(jìn)行18S rDNA序列的擴(kuò)增。送檢測序，將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAST比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 酶活力測定 對硝基苯酚 (4－nitrophenyl β－D－glucopyranoside，pNPG)作為底物，反應(yīng)體系為2 mL，先將1 mL pNPG(5 mmol/L)和0.9 mL pH 5.0 Na2HPO4－檸檬酸緩沖液混勻，再加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的β－葡萄糖苷酶粗酶制劑，50℃反應(yīng)10 min，立即加入3 mL l mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，室溫靜置5 min，于400 nm處測光吸收值 (A)［9］。

酶活定義:1 min內(nèi)催化產(chǎn)生1 μg對硝基酚的量定義為一個(gè)酶活力單位。

1.2.4 β－葡萄糖苷酶粗酶性質(zhì)研究

1)溫度對酶活的影響。

酶催化底物反應(yīng)10 min，在40～80℃溫度梯度范圍內(nèi)，分別測定β－葡萄糖苷酶的酶活，設(shè)最高酶活為100%;將粗酶液在40～80℃溫度梯度內(nèi)保溫1 h，然后用標(biāo)準(zhǔn)pNPG法測定酶活，設(shè)最高酶活為100%。

2)pH值對酶活的影響。

配制不同pH值的Na2HPO4－檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，在50℃條件下，分別在pH值為4.0～5.4條件下測定β－葡萄糖苷酶酶活，設(shè)最高酶活為100%;將粗酶液在pH值為4.0～5.4條件下放置1 h，然后用標(biāo)準(zhǔn)pNPG法測定酶活，設(shè)最高酶活為100%。

3)乙醇體積分?jǐn)?shù)對酶活的影響。

在測定酶活反應(yīng)體系中分別添加體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%的乙醇，測定β－葡萄糖苷酶的酶活保留情況。以未加入乙醇處理的作為陰性對照組，設(shè)其酶活為100%。

1.2.5 β－葡萄糖苷酶粗酶同步糖化發(fā)酵應(yīng)用

反應(yīng)體系為:500 mL搖瓶中裝反應(yīng)液200 mL，該反應(yīng)體系含有汽爆秸稈20 g，其中液體組分包括無機(jī)鹽成分 ((NH4)2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.025 g/L)，酵母膏 1.0 g/L，其余為 pH 4.8的Na2HPO4－檸檬酸緩沖液。

向反應(yīng)體系加入纖維素酶 (30 FPU/g底物)酶量，50℃預(yù)水解24 h;然后加入β－葡萄糖苷酶 (30 FPU/g底物)到反應(yīng)體系中，最后按5%(體積比)接種量接種經(jīng)活化的釀酒酵母至反應(yīng)體系，37℃發(fā)酵，以接種酵母時(shí)計(jì)為0 h，并于0、4、8、12、24、48、96和120 h定點(diǎn)取樣，HPLC檢測乙醇生成和還原糖的減少情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β－葡萄糖苷酶菌株篩選

經(jīng)剛果紅平板法重復(fù)篩選3次，并利用發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩，對所產(chǎn)粗酶液進(jìn)行β－葡萄糖苷酶酶活測定，發(fā)現(xiàn)其中1株菌W63具有高產(chǎn)β－葡萄糖苷酶活力，該菌所產(chǎn)β－葡萄糖苷酶的酶活可高達(dá)482.1 U/mL。

圖1 肉座菌Hypocrea sp.W63的18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic analysis of Hypocrea sp.W63 based on 18S rDNA sequence

根據(jù)真菌18S rDNA通用引物 (NS1，NS8)所獲得的序列長度為1666 bp，為了確定W63的分類地位［10］，將 W63的18S rDNA序列在 NCBI上的比對分析，并結(jié)合MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株W63與肉座菌屬Hypocrea sp.的同源性為99%;又根據(jù)同源序列搜索，并且下載一些相關(guān)菌種的18S rDNA序列，從中挑取6個(gè)菌株的的18S rDNA進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株W63與Hypocrea muroiana的進(jìn)化距離最短，其親緣關(guān)系也是最接近的，這與BLAST比對的結(jié)果相一致。兩者的遺傳距離為0.0001。序列相似性 99.8%。

圖2 肉座菌Hypocrea sp.W63電鏡掃描圖Fig.2 Scanning electron microscopy of Hypocrea sp.W63(A:7500×;B:30000×)

形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，該菌在PDA平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)1 d迅速長出白色菌絲，培養(yǎng)3 d以上開始產(chǎn)綠色孢子。菌絲體呈白色，菌絲小而致密，呈棉絮狀，培養(yǎng)后期可產(chǎn)綠色的木霉。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，其菌絲體成節(jié)生長，沒有鞭毛，孢子呈棉絮狀，附著在菌絲體上，子囊殼包埋在肉質(zhì)的子座中，子座由擬薄壁組織組成 (圖2)。

因此，根據(jù)18S rDNA比對分析和形態(tài)學(xué)、顯微鏡觀察結(jié)果，將其命名為肉座菌Hypocrea sp.W63。

2.2 粗酶的最適溫度及其熱穩(wěn)定性

一般情況下，真菌β－葡萄糖苷酶的最適作用溫度在40～50℃，相比之下，真菌的嗜熱β－葡萄糖苷酶最適作用溫度可達(dá)55～75℃［11］。本研究發(fā)現(xiàn)的Hypocrea sp.W63所產(chǎn)的β－葡萄糖苷酶在65℃時(shí)具有最大酶促反應(yīng)速度，在60℃以下能保持較長時(shí)間的穩(wěn)定，60℃溫浴條件下酶活能保留98.5%。當(dāng)溫度高于70℃時(shí)，酶蛋白快速變性，酶活迅速喪失。根據(jù)Michael W.Bauer等［12］對來自嗜熱性和非嗜熱性β－葡萄糖苷酶的研究認(rèn)為，兩者在相互演化過程中發(fā)生的酶修飾作用并不改變酶的活性中心，也不改變其專一性，只是將酶蛋白結(jié)構(gòu)作部分調(diào)整以適應(yīng)高溫環(huán)境。通常情況下，木質(zhì)纖維素酶解作用在50℃下反應(yīng)24～72 h，在這期間酶活逐漸降低成為酶解反應(yīng)的制約因素，β－葡萄糖苷酶的持續(xù)熱穩(wěn)定性能極大提高酶對生物質(zhì)混合物的酶解效果［13］。

圖3 溫度對肉座菌Hypocrea sp.W63產(chǎn)的β－葡萄糖苷酶粗酶活性的影響Fig.3 Effects of temperature on crude β－glucosidase enzyme activity

該酶的最適反應(yīng)溫度如圖3所示，目前大多數(shù)纖維素糖化反應(yīng)在50℃條件下進(jìn)行，將Hypocrea sp.W63所產(chǎn)的嗜溫β－葡萄糖苷酶糖化反應(yīng)溫度由50℃提高到60℃，其活性可提高約20%，它可以大大提高酶糖化效率和適用范圍。

2.3 粗酶的最適pH及其酸堿穩(wěn)定性

測定不同pH對酶活的影響，從圖4可知，該酶的pH測定范圍在4.0～5.5在之間，在pH值為4.5～5.5時(shí)酶活穩(wěn)定性較好，達(dá)80%以上。其最適水解pH值為4.8，且在pH為4.8時(shí)酶活穩(wěn)定性最高，與大多數(shù)纖維素酶相似［14－15］，該酶屬于酸性水解酶類。

圖4 肉座菌Hypocrea sp.W63產(chǎn)的β－葡萄糖苷酶最適pH值及pH穩(wěn)定性Fig.4 The optimum pH value and stability about β－glucosidase

里氏木霉T.reesei作為最常用的纖維素酶產(chǎn)酶菌株，很多木霉的種類與肉座菌密切相關(guān)，而肉座菌屬為木霉的有性發(fā)育階段的其中一個(gè)種屬，肉座菌為木霉的有性型，兩者在某個(gè)發(fā)育階段的名稱互相通用。我們研究中得到的嗜熱β－葡萄糖苷酶，具有較高的酶活反應(yīng)溫度和pH值穩(wěn)定性，昭示著該酶在用木質(zhì)纖維素原料水解應(yīng)用中具有較好的應(yīng)用前景［16］。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對酶活力的影響

在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇情況下，乙醇體積分?jǐn)?shù)對β－葡萄糖苷酶的酶活力影響結(jié)果如圖5所示。低體積分?jǐn)?shù)乙醇能有效提高β－葡萄糖苷酶的酶活，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，對酶活力提高有較明顯的促進(jìn)效果，即使乙醇體積分?jǐn)?shù)高達(dá)30%，仍然對β－葡萄糖苷酶酶活無任何抑制作用。同時(shí)，該酶在乙醇體積分?jǐn)?shù)20%以下能保持較好的穩(wěn)定性。綜合上述研究，β－葡萄糖苷酶較強(qiáng)的嗜溫、耐溫、耐乙醇性能，尤其適合應(yīng)用于木質(zhì)纖維素原料的同步糖化發(fā)酵應(yīng)用中。

圖5 肉座菌Hypocrea sp.W63產(chǎn)的β－葡萄糖苷酶對乙醇的耐受性Fig.5 Ethanol tolerance about β － glucosidase

研究表明，有機(jī)溶劑對β－葡萄糖苷酶的激活是由于乙醇的存在改變了水的電勢，使得β－葡萄糖苷酶具有更明顯的親核活性，從而導(dǎo)致更高的親核取代反應(yīng)率［17］。本研究所得的β－葡萄糖苷酶穩(wěn)定性在高溫和有機(jī)溶劑存在的增加，在提高現(xiàn)有的生物技術(shù)的應(yīng)用潛力和新的可持續(xù)技術(shù)有很好的前景［18］。此外，來源不同的β－葡萄糖苷酶，其酶學(xué)性質(zhì)會(huì)存在著差異。此類β－葡萄糖苷酶在非水相中不易失活，可有望用于有機(jī)合成或生物轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用，但反應(yīng)介質(zhì)的不同，對酶的活性及酶選擇性影響很大［19］。

2.5 β－葡萄糖苷酶應(yīng)用于同步糖化發(fā)酵

內(nèi)切型葡聚糖酶和外切型葡聚糖酶都會(huì)受到纖維二糖的反饋抑制作用，而β－葡萄糖苷酶能夠?qū)⒗w維二糖降解成葡萄糖，解除纖維二糖的抑制作用［20］。纖維質(zhì)原料同步糖化發(fā)酵 (SSF)是一種運(yùn)用纖維素酶解產(chǎn)生的葡萄糖立即為酵母所發(fā)酵利用的工藝技術(shù)。但在SSF反應(yīng)過程中也會(huì)隨著發(fā)酵乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，進(jìn)而對β－葡萄糖苷酶酶活力乃至整個(gè)酶解過程產(chǎn)生抑制作用［21］。而本研究獲得的耐醇β－葡萄糖苷酶可以有效避開這一缺陷。

針對纖維素酶系中β－葡萄糖苷酶的相對不足，可通過基因工程手段提高β－葡萄糖苷酶的分泌量、或和某些β－葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株混合培養(yǎng)、或水解過程中添加外源β－葡萄糖苷酶的方法來解決，其中添加外源β－葡萄糖苷酶的工藝相對簡單易行，容易在工業(yè)規(guī)模上實(shí)現(xiàn)［22－23］。添加外源β－葡萄糖苷酶有利于降低水解糖液中的纖維二糖含量，提高終產(chǎn)物葡萄糖的含量，從而提高纖維素水解得率和水解糖液中可發(fā)酵性糖的比例，從而提高終產(chǎn)物乙醇體積分?jǐn)?shù)。本研究將篩選所得肉座菌Hypocrea sp.W63菌株產(chǎn)的β－葡萄糖苷酶粗酶液添加到同步糖化發(fā)酵中，結(jié)果如圖6所示。研究結(jié)果表明，可發(fā)酵性總糖質(zhì)量濃度明顯增加，發(fā)酵所得乙醇產(chǎn)量明顯高于陰性 (不添加外源β－葡萄糖苷酶)、陽性 (添加Sigma公司β－葡萄糖苷酶)對照反應(yīng)，發(fā)酵至120 h乙醇產(chǎn)量最高，乙醇含量高達(dá)41.25 g/L，與陰性、陽性對照相比，乙醇產(chǎn)量提高近2倍。

圖6 β－葡萄糖苷酶添加對同步糖化發(fā)酵效果的影響(實(shí)心曲線代表ρ(總糖)，空心曲線代表ρ(乙醇))Fig.6 Effects of adding β － glucosidase on simultaneous saccharification and fermentation

研究中采用的酶液為粗酶液，除主要有β－葡萄糖苷酶外，還含有部分纖維素內(nèi)切酶、外切酶、半纖維素酶等，β－葡萄糖苷酶能有效降低水解液中纖維二糖質(zhì)量濃度，提高纖維素水解得率及可發(fā)酵性糖比例，直接提升了同步糖化發(fā)酵中乙醇的產(chǎn)量。研究結(jié)果表明，肉座菌Hypocrea sp.W63菌株所產(chǎn)的β－葡萄糖苷酶性質(zhì)有利于纖維素同步糖化發(fā)酵應(yīng)用，有效消除終端產(chǎn)物纖維二糖的抑制。并且該菌株所產(chǎn)的β－葡萄糖苷酶酶活力較高，應(yīng)用于同步糖化發(fā)酵過程具有明顯的促進(jìn)效果，對于加速纖維素乙醇的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

肉座菌Hypocrea sp.W63所產(chǎn)β－葡萄糖苷酶的酶活可高達(dá)482.1 U/mL，其β－葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度為65℃，在60℃時(shí)有高度穩(wěn)定性，最適反應(yīng)pH為4.8。低體積分?jǐn)?shù)乙醇能有效提高β－葡萄糖苷酶的酶活，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，對酶活力提高有較明顯的促進(jìn)效果，即使乙醇體積分?jǐn)?shù)高達(dá)30%，仍然對β－葡萄糖苷酶酶活無任何抑制作用。

添加本研究所得的β－葡萄糖苷酶應(yīng)用于同步糖化發(fā)酵，有效消除終端產(chǎn)物纖維二糖的抑制，明顯提高可發(fā)酵性糖比例，發(fā)酵至120 h，乙醇含量高達(dá)41.25 g/L，所得乙醇產(chǎn)量比陰性、陽性對照提高了近2倍。

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