楊一丁 張 偉 楊文婷 高文勇

(1青島市市立醫(yī)院，青島，266071;2青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)，青島，266033;3山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南，250355;4青島四方嘉興路街道人民路社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站，青島，266033)

我們在本實(shí)驗(yàn)以醇浸物和大黃素為指標(biāo)，對活血通經(jīng)消瘀巴布劑組方藥物中的木芙蓉、紫草和大黃進(jìn)行乙醇提取工藝正交設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究，考察乙醇濃度，乙醇用量(倍)，提取時間(h)，提取次數(shù)等因素，確定最佳工藝條件。

1 儀器、試劑與藥材

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀二元泵DAD檢測器(美國);JA2003型電子分析天平(上海);超聲波清洗器:KQ100型(昆山市超聲波儀器廠)工作頻率40 kHz，輸出超聲電功率100 W;BuchiR215V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士)。

1.2 試劑 大黃素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:0756－00110);甲醇為色譜純(美國天地試劑公司)，乙醇為藥用，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材 藥材購自安徽亳州，經(jīng)青島市藥檢所吳愛英主任中藥師鑒定，木芙蓉葉為錦葵科植物木芙蓉Hibiscus mutabilis L.的葉，大黃為Rheum officinale Baill.的干燥根及根莖，紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma(Royle)Johnst的干燥根。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 醇浸物測定方法 量取醇提液10 mL，精密稱重，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱重。計(jì)算醇浸物含量［(g/g)×%］。

2.2 大黃素含量測定方法［1］

2.2.1 色譜條件 色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(4.6 mm × 250 mm，5 μm，Lichrospher，漢邦科技)，流動相為甲醇－0.1%磷酸溶液(85∶15)，流速1.0 mL/min;檢測波長為254 nm。理論塔板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取大黃素對照品1.408 2 mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得濃度為5.638 2 μg/mL的大黃素對照品溶液。分別精密吸取大黃素對照品溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、10.0、15.0μL，按2.1.1色譜條件測定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、大黃素量為橫坐標(biāo)，結(jié)果在選定的色譜條件下，大黃素含量在0.005 6～0.084 μg的范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系;回歸方程為y=361658x－368，r=0.999 5。

2.3 正交方案設(shè)計(jì) 以醇浸膏和大黃素提取率為指標(biāo)，以乙醇濃度，乙醇用量(倍)，提取時間(h)，提取次數(shù)為因素，進(jìn)行L9(34)的正交試驗(yàn)。正交因素和水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素和水平表

2.4 乙醇提取實(shí)驗(yàn) 將木芙蓉葉、紫草和大黃等3味藥藥材細(xì)粉(過40目篩)，按處方比例量分別稱取9份，每份100 g，分別按L9(34)表中給出的條件進(jìn)行提取，提取時間從沸騰開始時記錄。提取結(jié)束后，分別合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇至適量，再以無水乙醇定容至100.00 mL，得1－9號樣品液。

3 正交試驗(yàn)結(jié)果

1)分別精密量取“2.4乙醇提取實(shí)驗(yàn)”制得的1－9號樣品溶液各10 mL，按“2.1醇浸物測定方法”分別測定并計(jì)算1－9號樣品醇浸物含量(mg/g)。每個樣品重復(fù)測定3次，計(jì)算3次平均值。結(jié)果見表2。2)將1)步制得的其中1份1－9號醇浸物分別加8%的鹽酸10.00 mL溶解，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收三氯甲烷至干，殘?jiān)眉状既芙?、轉(zhuǎn)移并定容至10 mL，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，按“2.2大黃素含量測定方法”分別進(jìn)樣、測定，計(jì)算1－9號樣品大黃素含量(mg/g%)。每個樣品重復(fù)測定3次，計(jì)算3次平均值。結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)表及結(jié)果(n=3)

表3 醇浸物方差數(shù)據(jù)分析(n=3)

4 結(jié)果分析

以醇浸物提取率為指標(biāo)，影響因素從大到小依次為D＞A＞C＞B;其中A因素和D因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，B因素和C因素?zé)o顯著影響;最佳條件為A2B1C1D3。以大黃素提取率為指標(biāo)，影響因素從大到小依次為D＞A＞C＞B，其中A因素和D因素有非常顯著影響(P＜0.01)，C因素有顯著影響(P＜0.05)，B因素?zé)o顯著影響;最佳條件為A2B2C1D3。綜合醇浸物和大黃素提取率，考慮到B因素對這兩種指標(biāo)成分提取率均無顯著影響，選擇A2B1C1D3方案進(jìn)行工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果該方案兩種指標(biāo)成分提取率分別醇浸物為 2.4208［(g/g)×%］，大黃素為 241.22［(mg/g×%］。因此確定A2B1C1D3為最終生產(chǎn)工藝條件，即用濃度為60%的乙醇，提取3次，每次乙醇用量為藥材重量的6倍，每次提取時間為40min。

表4 大黃素方差數(shù)據(jù)分析(n=3)

5 工藝說明

5.1 關(guān)于提取方案 該巴布劑組方藥物中的木芙蓉、紫草和大黃，及提取揮發(fā)油后的乳香、沒藥、三棱、莪術(shù)等藥藥渣均含有醇溶性成分。木芙蓉主要化學(xué)成分為黃酮苷、酚類、氨基酸、鞣質(zhì)、還原糖、甾類化合物和揮發(fā)油類成分，其中黃酮苷是其主要活性成分［2－3］，具有抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用［4］。姚莉韻［5］實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為乙醇回流提取總黃酮效果大大高于水煎法、溫浸法，回流提取的最佳工藝條件是用12倍量70%乙醇提取3次，每次3h，其中乙醇濃度是影響提取率的主要因素。大黃主要含蒽醌類化合物，總量為1.01% ～5.19%［6］。蔣孟良等［7］比較幾種提取方法對總蒽醌提取影響，結(jié)果認(rèn)為醇提＞滲漉＞水提，熱提強(qiáng)于冷提。朱雪瑜等［8］研究認(rèn)為60% ～80%乙醇濃度對大黃總蒽醌(游離蒽醌和結(jié)合蒽醌)有較好的提取效果，最佳工藝為用70%的乙醇提取3次，每次1 h，溶劑量為藥材的10、8、8倍。紫草主要生物活性成分為萘醌類等多種化合物［9－10］，乙醇濃度對萘醌收率有顯著影響［11］。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以乙醇為溶媒進(jìn)行正交設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定最佳工藝條件。

圖1 高效液相色譜圖

5.2 關(guān)于大黃素含量測定方法 參考含大黃復(fù)方制劑大黃素含量測定的有關(guān)報(bào)道資料，先后對流動相甲醇 －0.1% 磷酸(80∶20)［12－13］、甲醇 － 0.1% 磷酸(85∶15)［14］、甲醇 － 0.2% 磷酸(84∶16)［15］、甲醇 － 0.2%磷酸(70∶30)［16］、乙腈 － 甲醇 － 1% 磷酸(35∶37∶28)［17］、甲醇 － 水 － 冰醋酸(72∶28∶1.0)［18］等系統(tǒng)進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)，觀察系統(tǒng)分離效果。結(jié)果表明，用甲醇－0.1%磷酸溶液(85∶15)作為流動相測定樣品中大黃素含量較為適宜，出峰時間短，陰性對照品無干擾(見圖1)。確定大黃素含量測定的色譜條件。

5.3 關(guān)于精密度和重復(fù)性 對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次大黃素峰面積的RSD為1.48%，2號乙醇提取液按“3.2”步處理后依次進(jìn)樣5次大黃素峰面積積分值的RSD值為1.19%，表明該色譜條件的精密度和重復(fù)性良好。

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