周正華 杜安全 王先榮 王德群 劉守金 梁益敏

(1安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，合肥，230061;2安徽中醫(yī)學(xué)院，合肥，230038)

銀杏Ginkgo biloba L.屬裸子植物，是銀杏科銀杏屬唯一生存種，是我國特有的古樹種之一。銀杏葉主要有效成分是黃酮類化合物和萜類內(nèi)酯，能有效改善心腦血管和末梢循環(huán)，用于治療動脈硬化、高血壓、腦卒中等心腦血管疾病。其中銀杏內(nèi)酯主要有銀杏內(nèi)酯A、B、C(Ginkgolide A、B、C)和白果內(nèi)酯(Bilobalide)等。我們于1997年至1999年間，研究了安徽省不同產(chǎn)區(qū)、不同栽培品種和不同生長年限銀杏葉總黃酮苷和總內(nèi)酯的含量［1－5］。本文是研究安徽省不同產(chǎn)區(qū)不同栽培品種銀杏葉中萜內(nèi)酯的含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器和試藥

美國Waters公司高效液相色譜儀(600型泵，410示差折光檢測器)，Perkin－Elmer天平，C18萃取小柱(Waters公司)。對照品 Ginkgolide A、B、C和 Bilobalide由本組自制，經(jīng)四譜鑒定，純度經(jīng)HPLC分析，含量大于99%。銀杏葉樣品由安徽中醫(yī)學(xué)院王德群教授采集并鑒定。試劑:甲醇為色譜純，水為重蒸水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜條件 色譜柱:大連依利特Hyper ODS2 C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃。流動相:甲醇 － 水(33∶67)，流速 1.0 mL/min。

2.2 對照品溶液的制備 分別取內(nèi)酯對照品Ginkgolide A、B、C 和Bilobalide 1.5 mg，精密稱定，以流動相溶解定容至10 mL，搖勻，即得。

表1 安徽省不同產(chǎn)區(qū)不同栽培品種銀杏葉總內(nèi)酯的含量(n=3)

2.3 供試品溶液的制備 取干燥的銀杏葉細粉0.5 g，精密稱定，放入25 mL圓底燒瓶中，加入10%甲醇5mL，于150℃油浴中回流提取15 min，趁熱抽濾，殘渣用2%甲醇2 mL洗滌，抽干，繼續(xù)用10%甲醇4 mL同法提取，過濾，合并提取液待上柱。稱取0.5 g聚酰胺裝入小層析柱，下口接C18小柱，先用甲醇10 mL洗脫，再用2%甲醇10 mL洗脫，然后在聚酰胺柱上緩慢加入銀杏葉提取液，瓶用2%甲醇5 mL洗3次，洗液一并加入聚酰胺柱，待快干時，用5%甲醇5mL洗脫，減壓抽干，棄去聚酰胺小柱，C18小柱先用蒸餾水1 mL洗滌，再用正己烷6 mL洗滌，棄去洗滌液，最后用乙酸甲酯－正己烷(4∶6)10 mL洗脫，并收集于20 mL圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸干，殘留物準(zhǔn)確加入流動相2 mL使溶解，即得。

2.4 樣品測定 根據(jù)安徽省緯度分布，分別采集8、9月份安徽省6個產(chǎn)區(qū)不同栽培品種的銀杏葉制備供試品溶液，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各100 μL，分別注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定峰面積，用外標(biāo)法計算，即得總內(nèi)酯含量，結(jié)果見表1。

2.5 方法學(xué)考察 參見我們已發(fā)表銀杏內(nèi)酯含量測定的論文［1］標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為:Bilobalide回歸方程Y=－215+1 413X;相關(guān)系數(shù)為 0.999 7;線性范圍:4.3758～20.879 μg。Ginkgolide A 回歸方程 Y=97+1377X;相關(guān)系數(shù)為 0.998 4;線性范圍:5.0760～25.380 μg。Ginkgolide B 回歸方程 Y= －260+1 278X;相關(guān)系數(shù)為 0.999 3;線性范圍:5.973 0～29.865 μg。Ginkgolide C回歸方程Y= －48+1 334X;相關(guān)系數(shù)為0.999 1;線性范圍:5.026 2～25.131 μg。

加樣回收實驗結(jié)果:Bilobalide為97.9%，Ginkgolide A為97.2%，Ginkgolide B為98.9%，Ginkgolide C為98.2%。

3 結(jié)論

根據(jù)安徽省緯度分布，選取6個代表性的地區(qū)，用HPLC法測定了不同地區(qū)不同栽培品種銀杏葉總內(nèi)酯含量。由實驗結(jié)果可知，不同產(chǎn)區(qū)不同栽培品種銀杏葉總內(nèi)酯的含量差別較大。本研究可為安徽省不同地區(qū)合理栽培銀杏提供參考。

［1］王先榮，周正華，杜安全，等.不同生長季節(jié)及生長年限銀杏葉總萜內(nèi)酯含量的相關(guān)性研究［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報，2000，31(2):88－90.

［2］杜安全，王先榮，周正華，等.銀杏葉提取物中銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯的提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定［J］.江蘇藥學(xué)與臨床研究，2001，9(3):1－3.

［3］杜安全，王先榮，周正華，等.不同生長季節(jié)及生長年限銀杏葉總黃酮甙含量的相關(guān)性研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開，2000，12(2):49.

［4］杜安全，王先榮，周正華，等.銀杏葉總黃酮苷的HPLC法分析水解條件［J］.安徽醫(yī)藥，2001，5(3):164 －165.

［5］杜安全，周正華，王先榮，等.安徽省不同產(chǎn)區(qū)和不同栽培品種銀杏葉總黃酮苷含量的研究［J］.現(xiàn)代中藥研究與實踐，2007，21(1):35－36.