朱路平 趙宜紅 孫 曼 楊景華 周 甜 趙新年 張雁冰 李寅超

(1河南省疾病預(yù)防控制中心，鄭州，450003;2鄭州大學(xué)藥學(xué)院，鄭州，450001;3河南省新四方制藥有限公司，周口，466000)

阿膠補(bǔ)血軟膠囊是河南省新四方制藥有限公司在已上市的阿膠補(bǔ)血膏原劑型基礎(chǔ)上的改進(jìn)制劑，由阿膠、熟地黃、黃芪、黨參、枸杞子等6味藥組成［1］，具有益氣補(bǔ)血之功效，用于久病體弱，氣虛血虧。為了明確新劑型的有效性和與阿膠補(bǔ)血膏的等效性，我們對(duì)阿膠補(bǔ)血軟膠囊的小鼠急性毒性及耐缺氧作用進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)研究［2］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察阿膠補(bǔ)血軟膠囊對(duì)小鼠失血性貧血的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品 阿膠補(bǔ)血軟膠囊，紅褐色粉末，由河南省新四方制藥有限公司提供，批號(hào)20110318，規(guī)格:每1 g相當(dāng)于生藥4.26 g，擬臨床劑量為0.061 3 g·kg－1，4℃冰箱密封保存;復(fù)方阿膠漿(陽(yáng)性對(duì)照藥);阿膠補(bǔ)血膏(原劑型對(duì)照藥)，由河南省新四方制藥有限公司提供，批號(hào)20110215;生理鹽水(N.S)，河南太龍藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)11081021。

1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠(雌雄各半)SPF級(jí)，體質(zhì)量(20±2)g，河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(豫)2010－0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):0000877;飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房IVC設(shè)備，使用許可證號(hào):SYXK(豫)2007－0009。適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后供試驗(yàn)用。

1.3 試劑 EPO試劑盒(美國(guó) R＆D公司，批號(hào):201108);蒸餾水(自制);XFA6030型全自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀(南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司);TG16－W型微量高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司);DJ－5000C型電子天平(中外合資亞太電子天平廠);AR1140型分析天平(梅特勒－托利多儀器上海有限公司);CDG3022A型酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀(國(guó)營(yíng)華東電子管廠)［3］。

1.4 模型的制作 對(duì)照組及各給藥組小鼠，自造模之日起隔日由眼底后靜脈叢放血0.15 mL·10g－1;同時(shí)改變其正常飲食量，飼料控制在每日75 g·kg－1體重［4］，自由飲水，連續(xù) 7 d。

1.5 動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、模型對(duì)照組、復(fù)方阿膠漿組、阿膠補(bǔ)血膏組、阿膠補(bǔ)血軟膠囊0.55、1.10、2.21 g·kg－1劑量組，12 只/組，雌雄各半。各給藥組于造模前7d給相應(yīng)藥物，給藥體積20 mL·kg－1，每日1次，連續(xù)灌胃至造模第8天(即給藥第15天)。模型對(duì)照組和陰性對(duì)照組給予等體積生理鹽水。

1.6 小鼠外周血象的測(cè)定 在造模第0、4、7 d每只小鼠尾靜脈取血20 μL，檢測(cè)外周血RBC數(shù)和Hb濃度。

1.7 小鼠負(fù)重游泳時(shí)間測(cè)定［5］采用50 cm×40 cm×60 cm塑料水槽，水深約25 cm，水溫(20±0.5)℃。末次給藥40 min后，置小鼠在水槽中游泳，鼠尾根部負(fù)荷約10%體質(zhì)量［4］的鉛絲團(tuán)。實(shí)驗(yàn)時(shí)每個(gè)水槽每次放入陰性對(duì)照組、模型對(duì)照組、復(fù)方阿膠漿組、阿膠補(bǔ)血膏組、阿膠補(bǔ)血軟膠囊 0.55、1.10、2.21 g·kg－1劑量組小鼠各1只，并做好標(biāo)記，用秒表計(jì)時(shí)，記錄小鼠頭部沒(méi)于水面下5 s不能上浮的時(shí)間，作為小鼠游泳時(shí)間(min)。

1.8 小鼠血清EPO的測(cè)定 于小鼠造模后第8天負(fù)重游泳后，置籠中擦干休息5 min后摘眼球取血，制備血清，按 ELISA 法測(cè) EPO 含量［6－7］。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)失血性貧血小鼠外周血RBC的影響 模型對(duì)照組小鼠外周血中RBC總數(shù)自造模之日起至造模結(jié)束，均顯著低于陰性對(duì)照組(P＜0.01)。阿膠補(bǔ)血軟膠囊各劑量組在給藥14 d(造模第7天)時(shí)外周血RBC數(shù)與模型對(duì)照組比均有明顯升高，其中0.55 g·kg－1劑量組顯著升高(P＜0.05)，與阿膠補(bǔ)血膏效果接近。見(jiàn)表1。

表1 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對(duì)失血性貧血小鼠外周血RBC的影響(±s，n=12)

表1 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對(duì)失血性貧血小鼠外周血RBC的影響(±s，n=12)

注:與模型對(duì)照組比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;表中數(shù)據(jù)下標(biāo)為當(dāng)日動(dòng)物存活只數(shù)(以下同)。

0 d 4 d 7 d陰性對(duì)照 等體積N.S 7.60±0.43 7.35±0.67＊＊ 7.68±0.44組別 劑量/g·kg－1 造模開(kāi)始各時(shí)間點(diǎn)RBC總數(shù)/×1012·L－1＊＊模型對(duì)照 等體積N.S 7.66±0.48 5.66±0.56 5.90±0.51(10)復(fù)方阿膠漿 18mL·kg－1 7.95±0.57 5.97±0.92 6.74±0.41(11)＊＊阿膠補(bǔ)血膏 12 7.95±0.39 6.06±0.42 6.63±0.62＊＊阿膠補(bǔ)血軟膠囊 2.21 7.81±0.74 5.89±0.78 6.17±0.55(10)阿膠補(bǔ)血軟膠囊 1.10 7.77±0.50 5.61±1.03 6.19±0.41(11)阿膠補(bǔ)血軟膠囊 0.55 7.63±0.74 5.98±0.74 6.54±0.50(11)*

2.2 對(duì)失血性貧血小鼠外周血Hb的影響 與陰性對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠外周血中Hb含量自造模之日起至造模結(jié)束均顯著降低(P＜0.01)。阿膠補(bǔ)血軟膠囊給藥11 d(造模第4天)時(shí)2.21，1.10，0.55 g·kg－1劑量組 Hb含量顯著高于模型對(duì)照組(P＜0.05)，給藥14 d 時(shí)1.10，0.55 g·kg－1劑量組顯著高于模型對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)，與阿膠補(bǔ)血膏效果相當(dāng)?？梢?jiàn)阿膠補(bǔ)血軟膠囊可升高外周血中Hb含量，減輕放血法所致外周血象的下降趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

表2 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對(duì)失血性貧血小鼠外周血Hb的影響(±s，n=12)

表2 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對(duì)失血性貧血小鼠外周血Hb的影響(±s，n=12)

注:與4 d模型組比較，*P ＜0.05;與7 d模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與4 d、7 d陰性對(duì)照組比較，▲▲P ＜0.01。

N.S 136.25±7.25 127.58±9.54 132.17±6.87模型對(duì)照 等體積N.S 137.00±8.56 90.33±10.69▲▲ 101.90±9.11▲▲(10)復(fù)方阿膠漿 18mL·kg－1 141.58±14.92 99.58±16.04* 118.82±9.12(11)阿膠補(bǔ)血膏 12 137.50±7.60 102.42±7.12* 118.58±9.62阿膠補(bǔ)血軟膠囊 2.21 139.50±13.94 101.42±12.91* 108.60±7.98(10)阿膠補(bǔ)血軟膠囊 1.10 137.92±7.22 100.00±13.44* 118.64±27.26(11)△△阿膠補(bǔ)血軟膠囊 0.55 134.75±11.69 102.25±10.69* 114.73±10.56(11)0 d 4 d 7 d陰性對(duì)照 等體積組別 劑量/g·kg－1造模開(kāi)始各時(shí)間點(diǎn)Hb含量/g·L－1△

2.3 對(duì)失血性貧血小鼠血清EPO含量的影響 模型對(duì)照組小鼠眼底后靜脈叢放血合并限食造模8 d后，血清中EPO含量較陰性對(duì)照組明顯增加(P＜0.01)，這可能與機(jī)體自身反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。阿膠補(bǔ)血軟膠囊各劑量組EPO含量和模型對(duì)照組相比進(jìn)一步增加，且2.21 g·kg－1劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示這可能是其促進(jìn)造血功能的一個(gè)重要方面。見(jiàn)表3。

2.4 對(duì)失血性貧血小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響 與陰性對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠負(fù)重游泳持續(xù)時(shí)間顯著縮短(P＜0.05)。與模型對(duì)照組比較，阿膠補(bǔ)血軟膠囊能增加小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，其中2.21和1.10 g·kg－1劑量呈現(xiàn)較顯著的效果(P＜0.05)，表明阿膠補(bǔ)血軟膠囊能明顯增強(qiáng)失血性貧血小鼠肌力和耐力，提高其抗疲勞能力，其效果不弱于阿膠補(bǔ)血膏。

表3 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對(duì)失血性貧血小鼠血清EPO的影響(±s，n=6)

表3 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對(duì)失血性貧血小鼠血清EPO的影響(±s，n=6)

注:與模型對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01;與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組別 劑量/g·kg－1 EPO/IU·L －1陰性對(duì)照 等體積N.S 31.40±8.96＊＊0.55 66.87±27.66模型對(duì)照 等體積N.S 65.16±17.66復(fù)方阿膠漿 18mL·kg－1 70.25±20.61阿膠補(bǔ)血膏 12 81.91±31.41阿膠補(bǔ)血軟膠囊 2.21 90.41±21.06△阿膠補(bǔ)血軟膠囊 1.10 82.59±8.95阿膠補(bǔ)血軟膠囊

表4 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對(duì)失血性貧血小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響(±s)

表4 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對(duì)失血性貧血小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響(±s)

注:與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05。

組別 劑量(g·kg－1) 游泳時(shí)間(min)陰性對(duì)照 等體積N.S 5.90±3.40*模型對(duì)照 等體積N.S 2.05±1.11(10)復(fù)方阿膠漿 18mL·kg－1 5.83±2.07(11)*阿膠補(bǔ)血膏 12 5.84±2.46*阿膠補(bǔ)血軟膠囊 2.21 5.08±2.37(10)△阿膠補(bǔ)血軟膠囊 1.10 6.03±3.13(11)△阿膠補(bǔ)血軟膠囊 0.55 3.65±1.61(11)

3 討論

阿膠補(bǔ)血軟膠囊處方由阿膠、熟地黃、黃芪、黨參等為主要原料組成。其中，阿膠被歷代醫(yī)家稱(chēng)為補(bǔ)血“圣藥”［8］?，F(xiàn)代研究表明，阿膠作為一類(lèi)明膠蛋白，對(duì)促進(jìn)造血系統(tǒng)功能作用顯著，有加速RBC和Hb生長(zhǎng)，促進(jìn)骨髓造血，故有抗貧血作用［9］。熟地黃主治一切陰血不足之虛證，被譽(yù)為“壯水之主，補(bǔ)血之君”;熟地黃水煎劑及其提取物均有不同程度提高正常小鼠外周血象的趨勢(shì)，對(duì)血虛模型小鼠其補(bǔ)血作用更顯著［10］。黃芪補(bǔ)氣生血，用于氣血不足諸證?，F(xiàn)代研究證實(shí)［11－12］，黃芪能夠明顯提高動(dòng)物體能，改善動(dòng)物的疲勞狀態(tài)，并能夠減少血清和骨骼肌中乳酸的堆積，降低血清中乳酸脫氫酶和尿素氮的含量，以及降低血清和骨骼肌丙二醛的含量。黨參補(bǔ)中益氣，生津養(yǎng)血，用于氣血不足之證。藥理研究認(rèn)為，黨參具有抗疲勞和提高耐高溫能力，同時(shí)使RBC及Hb增加的作用［13］。上述作用均與本研究發(fā)現(xiàn)阿膠補(bǔ)血軟膠囊增加貧血小鼠RBC數(shù)和Hb含量功能密切相關(guān)。

EPO作用于骨髓紅系祖細(xì)胞上的受體，促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞分化為原RBC，加速幼R(shí)BC分裂并促進(jìn)Hb的合成［14］。阿膠補(bǔ)血軟膠囊能夠增加血液中EPO含量，這可能是其促進(jìn)造血功能的一個(gè)重要方面。

小鼠游泳實(shí)驗(yàn)反映小鼠肌力、耐力、應(yīng)激能力等功能，也稱(chēng)Porsolt實(shí)驗(yàn)［15］。本實(shí)驗(yàn)圍繞阿膠補(bǔ)血軟膠囊增強(qiáng)失血小鼠耐力的功效進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示，阿膠補(bǔ)血膏和阿膠補(bǔ)血軟膠囊均能顯著增加小鼠游泳時(shí)間，表明阿膠補(bǔ)血軟膠囊能明顯增強(qiáng)失血性貧血小鼠肌力和耐力，其效果與阿膠補(bǔ)血膏相當(dāng)。

本模型為急性失血性貧血，動(dòng)物恢復(fù)會(huì)較快，若實(shí)施造模后治療性給藥，其治療效果勢(shì)必?zé)o法正確判斷，所以本實(shí)驗(yàn)為預(yù)防性給藥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠造成失血性貧血模型以后體能明顯下降，RBC數(shù)目和Hb含量明顯降低，EPO等激素則反射性地合成增加。阿膠補(bǔ)血軟膠囊在提高動(dòng)物體能的同時(shí)，其RBC和Hb異常明顯改善，刺激EPO的分泌，促進(jìn)造血。這些結(jié)果為阿膠補(bǔ)血軟膠囊的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］李寅超，吳翠萍，楊景華，等.阿膠補(bǔ)血軟膠囊對(duì)小鼠的急性毒性及耐缺氧作用［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31(23):1942 －1944.

［2］李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.2版.上海科學(xué)技術(shù)出版社，1990:164－165.

［3］崔瑛，房曉娜，王會(huì)霞，等.地黃不同炮制品補(bǔ)血作用研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20(1):20 －22.

［4］郭飛，孫遠(yuǎn)嶺，周緯，等.運(yùn)脾方不同劑量對(duì)小鼠游泳時(shí)間作用的研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，20(18):2228－2229.

［5］廖世初，孫建寧.膠芪養(yǎng)血顆粒對(duì)失血疊加疲勞所致氣血虧虛小鼠體能及造血功能的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15(10):70－71.

［6］侯士良.中藥八百種詳解［M］.2版.鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社，2009:837－839.

［7］黃霞，慶慧，王惠森，等.熟地水煎劑及其提取物對(duì)小鼠外周血象影響的比較研究［J］.中成藥，2002，24(2):111－113.

［8］文鏡，趙建，朱曄，等.利用失血性貧血?jiǎng)游锬Ｐ驮u(píng)價(jià)含EPO因子功能食品的方法［J］.食品科學(xué)，2002，23(7):45－46.

［9］顧建軍.復(fù)方阿膠漿治療貧血37例［J］.世界中醫(yī)藥，2012，7(4):310－311.

［10］張淹，胡永水，郝向慧，等.復(fù)方阿膠漿現(xiàn)代臨床研究與應(yīng)用［J］.中國(guó)藥物評(píng)價(jià)，2012，29(3):247 －250.

［11］彭亮，姚思宇，傅偉忠，等.當(dāng)歸阿膠口服液改善大鼠缺鐵性貧血的效果評(píng)價(jià)［J］. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，19(02):265－267.

［12］葉劍.淺議中藥阿膠的臨床應(yīng)用及藥理作用［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2012，32(5):79 －81.

［13］田霞，鄔曉娜，姜澤軒，等.復(fù)方阿膠漿配合葡萄糖硫酸亞鐵用于產(chǎn)后貧血的療效觀察［J］.國(guó)際中醫(yī)中藥雜志，2012，34(11):后插6－7.

［14］胡冬菊，張雪娟.復(fù)方阿膠漿治療巨幼細(xì)胞性貧血34例療效觀察［J］. 國(guó)際中醫(yī)中藥雜志，2012，34(11):后插5 －6.

［15］張荻，侯麗，孫韜，等.復(fù)方阿膠漿改善化療相關(guān)性貧血的臨床研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào):中醫(yī)臨床版，2012，19(03):15－18.