林 琳，崔業(yè)波，包海鷹

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

茯神 (Poria cum Radix Pini)為多孔菌科 (Polyporaceae)、真菌茯苓Wolfiporia cocos(Schwein.)Ryvarden＆Gilb的干燥菌核抱附著松根的部分[1]。茯神作為一種傳統(tǒng)菌物藥材，現(xiàn)代應(yīng)用研究較少，還局限在古方的應(yīng)用創(chuàng)新、真?zhèn)舞b定[2]方面，還未發(fā)現(xiàn)從茯神中分離純化得到相應(yīng)活性成分及單體化合物。鑒于現(xiàn)狀，旨在彌補(bǔ)其化學(xué)成分方面的研究不足，研制茯神與靈芝配伍的復(fù)方苓靈神蜜膏，并對(duì)其進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，為茯神應(yīng)用及功能性食品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 茯神化學(xué)成分的研究

1.1 材料與方法

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

茯神購(gòu)自長(zhǎng)春市吉林大藥房，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)包海鷹教授鑒定。

1.1.2 主要儀器

Finnigan－MAT.LCQ電噴霧質(zhì)譜儀、Bruker AM－600 MHz型核磁共振波譜儀、德國(guó)Bruker WERTREX型紅外檢測(cè)儀、日本島津BU－7500型紫外檢測(cè)儀、YLS－6B智能熱板儀 (淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)、小鼠飼養(yǎng)箱。

1.1.3 提取分離

茯神 (6 kg)置烘箱中40℃烘干，粉碎后過20目篩。分別采用石油醚30℃、氯仿50℃、丙酮65℃、甲醇70℃梯度提取3次;分別合并提取液，濃縮分別得到3.0 g、19.5 g、14.1 g、36.0 g提取物。

經(jīng)反復(fù)柱層析分離，從丙酮層得到化合物1、化合物2、化合物3;氯仿層得到化合物4、化合物5;石油醚層得到化合物4。

2 茯神復(fù)方產(chǎn)品苓靈神蜜膏的藥效學(xué)研究

將茯神與靈芝等藥材配伍，開發(fā)茯神復(fù)方產(chǎn)品苓靈神蜜膏，針對(duì)其鎮(zhèn)痛作用做以下藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.1 熱板法

2.1.1 藥物配置

陽(yáng)性藥:去痛片0.56 g·kg－1;陰性組:生理鹽水 (0.2 mL/10 g);給藥組。

復(fù)方水煎液的配制:分別取茯神與靈芝粉末5 g混勻，沸水煎煮3次，合并濃縮到浸膏狀態(tài)，得到水提取物為1.275 g，得率為12.75%，給藥劑量分別為1 g·kg－1、0.44 g·kg－1。

水溶性三萜成分的配置:分別取茯神、靈芝20 g配伍，用紗布包裹水煎煮3次，濃縮 (得率為12.5%)，然后用85%乙醇沉淀12 h，3次，高速離心乙醇層低壓濃縮后 (得率為 45.33%)，給藥劑量分別為 0.49 g·kg－1、0.2 g·kg－1。

粗多糖的配置:同樣分別取茯神、靈芝20 g配伍，用紗布包裹水煎煮3次，合并濃縮 (12.7%)，用85%乙醇沉淀12 h，3次，高速離心傾去乙醇液，合并沉淀，然后將沉淀反復(fù)用甲醇、丙酮洗滌，再用Savage試劑純化去掉蛋白成分(得率為 25.1%)，給藥劑量分別為 0.5 g·kg－1、0.2 g·kg－1。

苓靈神蜜膏劑量配置:取苓靈神蜜膏26.25 g，溶于50 mL蒸餾水中，制成0.525 g·mL－1溶液，小鼠給藥量為0.2 mL/10g。取苓靈神蜜膏10.5 g，溶于50 mL蒸餾水中，制成0.21 g·mL－1溶液，小鼠給藥劑量為 0.2 mL/10g。

2.1.2 動(dòng)物處理

取100只雄性小鼠，隨機(jī)分為陰性組、安定組、給藥組。飼養(yǎng)于正規(guī)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自然光照射，室溫為25℃，正常飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境2 d，第3天給藥組開始按體重給藥，0.2 mL/10g。連續(xù)給藥7 d，并觀察小鼠的活動(dòng)情況。實(shí)驗(yàn)整個(gè)過程嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物法則規(guī)程操作，實(shí)驗(yàn)完畢，對(duì)小鼠進(jìn)行脫臼處死，減少小鼠死亡時(shí)的痛苦。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行小鼠篩選，取體重為 (18±2)g雌性小鼠，將YLS－6B智能熱板儀調(diào)節(jié)到 (50±0.5)℃，預(yù)熱10 min，取雌性KM小鼠數(shù)只，將小鼠放置熱板上，記錄小鼠自投入熱板后到小鼠出現(xiàn)舔后足 (或跳躍反應(yīng))的時(shí)間，即為該鼠的疼痛閾值。將反應(yīng)潛伏期小于5 s或大于30 s的小鼠剔除，剩下的小鼠為合格小鼠。

取48只合格的雌性小鼠，隨機(jī)分為陰性組、陽(yáng)性組、給藥組。正常飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境2 d，第3天對(duì)陰性組、陽(yáng)性組和給藥組的小鼠進(jìn)行痛閾給藥前的測(cè)定并記錄，然后給藥組開始按體重給藥，0.2 mL/10g，連續(xù)給藥7 d，第8天，實(shí)驗(yàn)小鼠禁食不禁水8 h，給藥組按體重給藥，同時(shí)陰性組給同體積的生理鹽水，陽(yáng)性組給去痛片0.56 g·kg－1，分別給藥30 min、60 min后，再依次測(cè)定小鼠的痛閾。鎮(zhèn)痛作用通過比較給藥組與陰性組小鼠反應(yīng)潛伏期表現(xiàn)出來。

2.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與統(tǒng)計(jì)分析

提高痛閾百分比 (P)公式為:

式中:Y1表示給藥后的痛閾;Y0表示給藥前的痛閾。

陰性組的提高痛閾百分比為0%;小鼠疼痛潛伏期采用mean±SD表示，分別通過T－test比較給藥后30 min、60 min后的給藥組和陰性組間的顯著性，當(dāng)p＜0.05說明在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著，p＜0.01說明在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異非常顯著。鎮(zhèn)痛作用采用提高痛閾百分比表示[3－7]。

2.2 扭體法

2.2.1 藥物配置

陽(yáng)性藥:安定給藥量為4 mg·kg－1，安定購(gòu)于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院。

陰性組:生理鹽水 (0.2 mL/10g)。

給藥組:水溶性三萜成分的配置同2.1.1項(xiàng)下方法;粗多糖的配置同2.1.1項(xiàng)下方法;苓靈神蜜膏劑量配置同2.1.1項(xiàng)下方法。

2.2.2 動(dòng)物處理

同2.1.2項(xiàng)下的方法。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

給藥組連續(xù)按體重給藥7 d，第8天實(shí)驗(yàn)小鼠禁食不禁水8 h，給藥組按體重給藥，同時(shí)陰性組給同體積的生理鹽水，陽(yáng)性組給4 mg·kg－1安定，給藥50 min后，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 0.5%冰醋酸溶液，然后測(cè)定15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)和扭體次數(shù)。受試藥的鎮(zhèn)痛作用通過比較給藥組和陰性組出現(xiàn)扭體反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)和扭體次數(shù)表現(xiàn)出來。

2.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與統(tǒng)計(jì)分析

鎮(zhèn)痛百分率 (M)公式為:

式中:n1表示空白組平均扭體次數(shù);n0表示給藥組平均扭體次數(shù)。

小鼠扭體次數(shù)采用mean±SD表示，通過T－test比較給藥組和陰性組間的顯著性，當(dāng)p＜0.05說明在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著，p＜0.01說明在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異非常顯著[8，9]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 茯神的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:白色的針狀結(jié)晶 (氯仿)，mp.167℃～178℃，可溶于氯仿、石油醚、乙酸乙酯等有機(jī)試劑不溶于甲醇、乙醇等極性大的溶劑。13C－NMR(CDCl13，100 MHz)δ:34.70(C－1)，30.13(C－2)，66.47(C－3)，36.94(C－4)，82.14(C－5)，135.41(C－6)，130.15(C－7)，79.41(C－8)，51.10(C－9)，36.99(C－10)，20.63(C－11)，39.35(C－12)，44.56(C－13)，51.69(C－14)，23.40(C－15)，28.63(C－16)，56.21(C－17)，12.87(C－18)，18.12(C－19)，39.71(C－20)，20.88(C －21)，135.20(C－22)，132.31(C－23)，42.77(C－24)，33.06(C－25)，19.63(C－26)，19.94(C－27)，17.55(C－28)。以上數(shù)據(jù)與姜北[10]等報(bào)道的麥角甾醇過氧化物的信息完全相符，由此判定化合物1為麥角甾醇過氧化物。

圖1 化合物3的DEPT－135核磁光譜圖

化合物2:系白色絹絲狀結(jié)晶 (氯仿)，溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇等有機(jī)試劑。分子量為528，EI－MS給出特征碎片峰510，453，435。13C －NMR(CDCl13，100 MHz)δ:35.40(C －1)，24.20(C－2)，80.77(C－3)，37.89(C －4)，50.62(C －5)，18.10(C－6)，26.51(C－7)，134.30(C－8)，134.54(C－9)，37.05(C－10)，20.57(C －11)，29.70(C－12)，46.18(C －13)，46.41(C－14)，42.78(C －15)，76.77(C －16)，56.95(C－17)，16.52(C －18)，19.16(C －19)，48.30(C －20)，179.79(C－21)，30.62(C－22)，32.22(C－23)，155.08(C－24)，33.87(C－25)，21.89(C －26)，21.78(C －27)，29.06(C－28)，17.40(C －29)，25.25(C －30)，107.10(C －31)。以上數(shù)據(jù)與仲佻金[11]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，鑒定化合物2為茯苓酸。

圖2 化合物3的DEPT－90核磁光譜圖

化合物3:系粉紅色油狀，溶于石油醚、氯仿等有機(jī)溶劑，微溶于甲醇、乙醇等極性較大的溶劑。分子量為179.03，分子式為 C10H10O3。13C －NMR(CHCl3)δppm 115.51、125.73、130.39 和155.11為苯環(huán)結(jié)構(gòu)，δppm 29.68、40.28為 CH2基團(tuán)，δppm 172.55為－CO－結(jié)構(gòu)。以氯仿為溶解的dept－135和dept－90的核磁共振光譜圖中可以得出，δppm 155.11為季碳;有5和CH基團(tuán)，2個(gè)CH2基團(tuán)。根據(jù)光譜數(shù)據(jù)和理化特征，鑒定化合物3為5－(4－羥苯基)二氫呋喃－2(3H)－酮[12]。

圖3 化合物4的DEPT－135核磁譜圖

化合物4:系質(zhì)地堅(jiān)實(shí)的白色粉末，并且有甜味，極易溶于水，可以溶于熱的甲醇。分子量為360，EI－MS給出特征碎片峰178.8、214.8、216.8、138.6碎片。從紅外譜圖中可以得出，1 024.20 cm－1、1 002.90 cm－1、1 080.14 cm－1、1 111.00 cm－1、1 148.57 cm－1、1 274.09 cm－1處有強(qiáng)吸收峰，表明有明顯的C－O伸縮振動(dòng)。在1 342.48 cm－1、1 371.38 cm－1、1 411.89 cm－1、1 425.40 cm－1、1 450.47 cm－1處有中強(qiáng)吸收峰，表明有C－H面內(nèi)彎曲振動(dòng);判斷為雙糖。從dept－135和dept－90中可以得出，本化合物具8個(gè)CH基團(tuán)，沒有甲基基團(tuán)，并且只有2個(gè)CH2基團(tuán)。因此鑒定化合物4是由2個(gè)葡萄糖組成的二糖化合物，連接方式為β－DGlu(3－1)α－D－Glu。

圖4 化合物4的DEPT－90核磁譜圖

化合物5:系藍(lán)綠色油狀液體，溶于石油醚、氯仿等有機(jī)溶劑，微溶于甲醇、乙醇等極性較大的溶劑。分子量為278。13C－NMR(CDCl13，100 MHz)δ:179.79(C－1)，134.54(C－2)，24.17(C－3)，28.93(C－4)，29.05(C－5)，29.70(C －6)，29.35(C －7)，26.48(C －8)，133.98(C－9)，127.16(C－10)，25.56(C－11)，128.22(C－12)，128.11(C－13)，25.65(C－14)，127.80(C－15)，130.14(C－16)，20.56(C－17)，14.26(C－18)。本文數(shù)據(jù)與楊倩等[13]報(bào)道的α－亞麻酸數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物5為α－亞麻酸，分子式為C18H30O2。

3.2 苓靈神蜜膏鎮(zhèn)痛作用的藥效學(xué)作用

3.2.1 熱板法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 熱板法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表1中可以得出，茯神與靈芝配伍的水提取物在1.0 g·kg－1(p＜0.05)、0.44 g·kg－1(p ＜ 0.05)劑量下，在給藥60 min后，明顯的提高了小鼠的疼痛潛伏期，分別的痛閾百分比為49%和37%;水溶性三萜成分劑量為0.49 g·kg－1，給藥60 min后，提高了小鼠痛閾31%，其它組均沒有表現(xiàn)出相關(guān)的作用。

3.2.2 扭體法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果

茯神與靈芝配伍的水提取物在1.0 g·kg－1(p＜0.01)、0.44 g·kg－1(p＜0.01)劑量下，可以明顯地抑制小鼠由冰醋酸誘導(dǎo)的局部疼痛，與陰性對(duì)照組比較，鎮(zhèn)痛比率分別為83.1%和76.3%，沒有呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性;水溶性三萜成分劑量為0.2 g·kg－1(p＜0.01)時(shí)，反而比 0.49 g·kg－1(p＜0.05)時(shí)更好地抑制了因冰醋酸誘導(dǎo)的局部疼痛;粗多糖可以明顯地抑制小鼠由冰醋酸誘導(dǎo)的局部疼痛，劑量為0.2 g·kg－1和 0.5 g·kg－1時(shí)，鎮(zhèn)痛率分別為 83.1% 和 84.9%，并與對(duì)照組比較p＜0.01，但是沒有出現(xiàn)很好的量效關(guān)系。

苓靈神蜜膏在劑量為 10.5 g·kg－1(p＜0.01)、4.2 g·kg－1(p＜0.01)條件下，與陰性對(duì)照組比較，可以明顯的減少小鼠的扭體次數(shù)，抑制因冰醋酸誘導(dǎo)的局部疼痛。鎮(zhèn)痛比率分別為77.34%、78.2%。并沒有明顯的劑量依賴性。

4 討論

通過薄層層析和硅膠柱層析方法，對(duì)茯神的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分離，并結(jié)合重結(jié)晶等方法進(jìn)行純化，其中麥角甾醇過氧化物是一類廣泛的存在于真菌中的甾醇類化合物，由于其特有的生物學(xué)性質(zhì)，具有很好的活性。Nakanishi T等[14]指出麥角甾醇過氧化物具有抗HIV－1病毒的活性。Kwon HC等[15]指出麥角甾醇過氧化物具有細(xì)胞毒性，藥物濃度在3.42 μg·mL－1～11.37 μg·mL－1時(shí)，對(duì) A －549、SK－MEL －2、XF－498和HCT－15細(xì)胞有明顯的細(xì)胞增殖抑制性。茯苓酸為茯苓素中主要的化合物，有報(bào)道茯苓素具有免疫調(diào)節(jié)和抗癌活性，在體內(nèi)還具有拮抗醛固酮活性。對(duì)人白血病細(xì)胞系HL－60有誘導(dǎo)分化作用[16]。5－(4－羥苯基)二氫呋喃 －2(3H)－酮，為首次在天然產(chǎn)物中分離得到的化合物。Signe Hφg和Petrine等[12]報(bào)道，通過合成的方法，得到5－(4－羥苯基)二氫呋喃－2(3H) －酮，以此為基礎(chǔ)，再合成GHB，GHB為GABA的代謝產(chǎn)物，臨床上多治療白天睡眠過多及昏睡性猝倒等疾病，本文則是首次在天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)該化合物，并為將來解釋茯神鎮(zhèn)靜安神作用的機(jī)理提供了重要的研究基礎(chǔ)，同樣也為GHB的研制增添了新的研究?jī)?nèi)容。β－D－Glu(3－1)α－D－Glu也是首次從茯神中分離得到二糖，現(xiàn)在對(duì)其的研究很少，還不明確其藥效。α－亞麻酸為也是首次在茯神分離得到，為人體必需脂肪酸，其在體內(nèi)不能自身合成，必須從體外攝取，具有廣泛的活性，被稱為“21世紀(jì)功能性食品主角”[13]。綜上所述，從茯神分離鑒定出的5個(gè)化合物，其中的麥角甾醇過氧化物、茯苓酸為茯神與茯苓共有的成分，但是其它3個(gè)化合物，由于文獻(xiàn)量不足，有待進(jìn)一步核對(duì)。

在鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中，茯神復(fù)方的主要活性成分為水溶性三萜成分，通過實(shí)驗(yàn)組間的比較，可以得出，水溶性三萜成分的鎮(zhèn)靜安神及抗焦慮作用的機(jī)理可能與中樞神經(jīng)抑制作用有關(guān);粗多糖對(duì)熱誘導(dǎo)的疼痛沒有提高小鼠的痛閾，而對(duì)冰醋酸誘導(dǎo)的疼痛具有明顯的活性，表明其粗多糖的作用機(jī)理同樣與中樞神經(jīng)抑制無關(guān)，可能與改善小鼠微循環(huán)有關(guān)，就其機(jī)理的研討有待進(jìn)一步研究。

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