王文兵，曹 旸，紀開萍，劉 靜，張春霞，何明霞

(云南省熱帶作物科學研究所，云南 景洪 666100)

暗褐網柄牛肝菌Phlebopus portentosus(Berk＆Broome)Boedijn，又名巨型牛肝菌、黑牛肝菌等，分布在中國云南、廣西和海南等地[1－3]，味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受產地消費者的喜愛，實現其人工栽培具有重要的意義。Lumyong和Sanmee[4，5]報道，在培養(yǎng)皿中以腐生菌的培養(yǎng)基培養(yǎng)暗褐網柄牛肝菌，可產生子實體和擔孢子，擔孢子能夠萌發(fā)，只是子實體的形態(tài)不好，且產量很低。

筆者曾設計不同覆土方法研究覆土對暗褐網柄牛肝菌子實體形成的影響，探討其出菇與覆土的密切相關性，并通過覆土中混入細菌、放線菌的對比試驗，發(fā)現覆土中的微生物對其子實體形成有一定的促進作用[6]。本文中，筆者通過覆土中放線菌的分離純化，回接無菌覆土進行對比栽培試驗，進一步研究了覆土中放線菌對暗褐網柄牛肝菌子實體生長的影響，并通過16S rDNA序列分析對有益放線菌菌株進行了初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 暗褐網柄牛肝菌菌株

菌株編號B－01－3－11，2003年由采自云南景洪鳳凰木 (delomix regia)樹下的野生子實體分離獲得，保存于云南省熱帶作物科學研究所，其人工培養(yǎng)的子實體憑證標本存放于中國科學院昆明植物研究所真菌標本室，標本編號:HKAS49706號。

1.1.2 覆土

由果園土壤、草炭等體積混合，加水至含水量60%。

1.1.3 培養(yǎng)基質

液體培養(yǎng)基 (每升):去皮馬鈴薯200.0 g(煮沸30 min)、葡萄糖20.0 g、酵母膏1.0 g、MgSO41.0 g、KH2PO41.0 g。

子實體培養(yǎng)料:干橡膠木鋸末10 kg、谷粒5 kg、MgSO415 g、KH2PO45 g，加水拌勻至含水量60%，pH在6左右。分裝入500 mL玻璃廣口瓶，每瓶鮮料400 g，121℃滅菌60 min。

1.2 方法

1.2.1 覆土中放線菌的分離

采用瓊脂平板稀釋分離法:覆土在室溫下風干10 d后取1 g加入10 mL無菌水，制成10%的土壤懸液。然后梯度稀釋使其終濃度達到10－6。取上述土壤懸液滴于加50 mg·L－1重鉻酸鉀抑制劑的改良高氏1號瓊脂培養(yǎng)基平板，均勻涂布，每個濃度3次重復。28℃培養(yǎng)7 d～15 d后挑取單菌落，轉接于改良高氏1號瓊脂斜面。28℃培養(yǎng)，待菌落長滿斜面后移至4℃冰箱保存。

1.2.2 放線菌回接覆土栽培試驗

暗褐網柄牛肝菌液體菌種、固體菌種及放線菌菌懸液的制備方法參照曹旸等[6]的方法。

待牛肝菌菌絲長滿廣口瓶中的固體培養(yǎng)基質后，進行覆土出菇試驗。覆滅菌土 (121℃，60 min)，并在無菌條件下分別添加各放線菌菌懸液，混勻，使覆土中放線菌濃度約為100 cfu·g－1，之后封口培養(yǎng)至覆土層長滿菌絲，再敞口培養(yǎng)[6]，以覆滅菌土為對照，覆土厚度4.0 cm，每處理7個重復。

將上述覆土后的栽培瓶移至磚混泡沫板菇房中，保持溫度28℃～30℃、光照100 lx～300 lx、濕度90%～95%培養(yǎng)。記錄牛肝菌菌絲在覆土層的生長情況、原基發(fā)生及子實體生長情況，并以Duncar新復極差法 (DPS7.0)對數據進行分析。

1.2.3 有益放線菌菌株16S rDNA序列分析

以SK1201－UNIQ－10柱式細菌基因組 DNA抽提試劑盒，生工生物工程 (上海)公司，提取有益放線菌基因組DNA。以PCR引物 Primer 27F(5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′)和 Primer 1492R(5′－GGTTACCTTGTTACGACTT －3′)進行PCR擴增，PCR反應體系:模板10 pmol;Primer 27F(10 μmol·L－1)1 μL;Primer 1492R(10 μmol·L－1)1 μL;dNTP mixture(10 Mm each)1 μL;10 × Taq Reaction Buffer 5 μL;Taq(5 U·μL－1)0.25 μL;加水至 50 μL。PCR 反應條件:預變性98℃、5 min;循環(huán)95℃、35 s，55℃、35 s，72℃、1 min、30 s，35個循環(huán);延伸8 min。

擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后割膠純化，并進行測序。根據測序結果，在GenBank中進行同源序列搜索，并調出相關的16S rDNA序列用Clustal X[7，8]軟件進行多序列比對，通過 MEGA3.1 軟件[9，10]選用 Kimura 2－parameter距離模型計算進化距離，用Neighbor－Joining法構建系統發(fā)育樹，1 000次隨機抽樣計算Bootstrap值以評估系統發(fā)育樹的置信度。

2 結果與分析

2.1 放線菌菌株對暗褐網柄牛肝菌出菇情況的影響

覆土中共分離純化得到37株放線菌菌株。通過回接覆土試驗檢測它們對暗褐網柄牛肝菌出菇情況的影響，見表1。

表1 放線菌菌株對暗褐網柄牛肝菌出菇情況的影響

續(xù)表

從表1中可以看出，覆土中加入放線菌菌株C20、T20、C6、36、34、T30、14的處理，牛肝菌菌絲長滿覆土層的時間比對照 (CK)提前3 d以上，達極顯著水平，說明這7個菌株能夠促進牛肝菌菌絲生長。

覆土中加入放線菌菌株T5、菌株9的處理，原基發(fā)生時間比CK提前10 d以上，達極顯著水平。在原基數目上，添加放線菌菌株9、菌株21的處理與對照相比達到極顯著差異水平。說明這四株放線菌能促進原基發(fā)生。

在子實體成熟數上，14個添加放線菌的處理在數值上高于CK，但所有處理與兩對照相比都沒有達到顯著差異水平。

在平均單菇重量上，添加放線菌菌株17、菌株T21的處理與對照相比達到顯著差異水平，是對照的3倍以上，說明菌株這兩株放線菌能夠促進子實體生長。

2.2 有益放線菌菌株16S rDNA序列分析

上述試驗中，對暗褐網柄牛肝菌出菇有促進作用的共有12株放線菌菌株，它們的16S rDNA測序結果經修正后已向GeneBank提交序列 (登錄號:JN248568～JN248579)。根據16S rDNA序列同源性，構建了包括這12株放線菌在內的系統發(fā)育樹，結果見圖1。

從16S rDNA序列聚類分析結果可以看出，12株放線菌中11株屬于鏈霉菌屬，1株屬于游動放線菌屬。

圖1 基于16S rDNA序列構建的系統發(fā)育樹

3 討論

由覆土中共分離純化得到37株放線菌菌株，通過回接覆土試驗檢測它們對暗褐網柄牛肝菌出菇情況的影響。其中有12個菌株分別在牛肝菌菌絲生長、原基發(fā)生及子實體生長等方面表現出促進作用。

16S rDNA序列分析結果顯示，12株放線菌中11株可歸為鏈霉菌屬 (Streptomyces)，1株歸為游動放線菌屬 (Actinoplanes)，將它們鑒定到種還需要進行進一步的生理生化試驗。

筆者曾報道在暗褐網柄牛肝菌人工栽培中，覆土及覆土中微生物的重要性[6]。本文結果表明，在覆土所包含的眾多微生物中，放線菌的幾個類群可能對暗褐網柄牛肝菌子實體的形成和生長有促進作用，但它們的作用機理還有待進一步的研究。

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