廖劍華

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350014)

雙孢蘑菇營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，是目前世界上人工栽培最廣泛、產(chǎn)量最高、消費(fèi)量最大的食用菌，產(chǎn)量約占世界食用菌總產(chǎn)量的40%左右，雙孢蘑菇也是我國(guó)目前最大宗的出口創(chuàng)匯食用菌。

應(yīng)用雙孢蘑菇同核不育株間雜交技術(shù)進(jìn)行品種的改良，獲得的雜交菌株已占蘑菇生產(chǎn)用種的100%。目前同核不育單孢雜交已成為世界上應(yīng)用最廣泛的方法，它通過(guò)單孢分離獲得自體不育的同核單孢子，這種單孢子是自體不育的，只有通過(guò)雜交成為異核體，才能出菇結(jié)實(shí)。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所利用同核不育單孢配對(duì)雜交，育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗逆的雙孢蘑菇雜交新菌株As2796、As4607等，占全省蘑菇用種量的95%，全國(guó)的80%，累計(jì)推廣應(yīng)用8×108m2以上，增產(chǎn)鮮菇300萬(wàn)t，新增菇農(nóng)收入100多億元[1]。

雙孢蘑菇雜交品種As2796自1992年選育成功至今已使用20年，在近年的栽培過(guò)程中表現(xiàn)出一些氣生菌株的特性，如在濕度較大、通氣不良的菇房中容易形成菌被，出菇過(guò)程中水分與通氣管理不當(dāng)容易產(chǎn)生叢菇，這些現(xiàn)象直接導(dǎo)致雙孢蘑菇的減產(chǎn)，為了減少在栽培中出現(xiàn)的這些不利特性，試圖與貼生親本菌株02進(jìn)行回交，改良As2796菌株的栽培特性，進(jìn)一步提高產(chǎn)量。經(jīng)過(guò)多次的回交試驗(yàn)，篩選獲得雜交新菌株W192，該菌株進(jìn)一步結(jié)合了高產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)特性，表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)快、不易長(zhǎng)菌被、產(chǎn)量高等優(yōu)良性狀，已通過(guò)福建省的新品種認(rèn)定，2012年～2013年產(chǎn)季推廣面積占福建省10%以上。

1 材料與方法

1.1 材料

供試雙孢蘑菇的異核體菌株02(H2型高產(chǎn)品種，引自荷蘭)、As2796(福建蘑菇菌種研究推廣站雜交菌株)，它們的同核體菌株208(HG4s)、286(Hs1)等菌株由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.2 方法

1.2.2 配對(duì)雜交技術(shù)

不育同核體的分離培養(yǎng)、鑒定與配對(duì)雜交技術(shù)，雜交菌株的分離、鑒定步驟均同前法[2－4]。

1.2.3 生物學(xué)特性測(cè)定

(1)溫度試驗(yàn) (栽培種培養(yǎng)基法測(cè)定)

同一菌株接種于含水60%的發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基中 (以發(fā)酵棉籽殼為主要基質(zhì)，添加牛糞粉、麥麩等輔助材料)，分別在 10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下培養(yǎng)，每種3次重復(fù)，觀察菌株在低溫與高溫下的走菌速率。

(2)培養(yǎng)基含水量試驗(yàn)

同一菌株分別接種于含水50%、55%、60%、65%和70%的發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基中 (以發(fā)酵棉籽殼為主要基質(zhì)，添加牛糞粉、麥麩等輔助材料)，在24℃下培養(yǎng)，每種3次重復(fù)，觀察菌株在不同含水量培養(yǎng)基中的走菌速率。

(3)pH值試驗(yàn)

PDA培養(yǎng)基分裝于500 mL的三角瓶中，高壓滅菌后，取幾個(gè)培養(yǎng)基未凝固的三角瓶，用1 mol·L－1HCl或 1 mol·L－1NaOH進(jìn)行pH值調(diào)節(jié)，準(zhǔn)確記錄調(diào)到各種pH值所需的HCl或NaOH的量，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)對(duì)各個(gè)三角瓶培養(yǎng)基進(jìn)行pH值調(diào)節(jié)，隨后立即倒入90 mm的培養(yǎng)皿制備成平板培養(yǎng)基。pH值檢測(cè)范圍4、5、6、7、8、9、10，每個(gè)pH值3次重復(fù)，觀察菌株在不同pH值下的走菌速率。

1.2.4 酯酶同工酶測(cè)定

酯酶同工酶電泳樣品制備、聚丙烯酰胺凝膠制備、電泳及結(jié)果分析方法均同前[5，6]。

1.2.5 栽培篩選

(1)初篩

所獲的雜交菌株以塑料淺箱進(jìn)行栽培，每個(gè)淺箱投二次發(fā)酵好的糞草培養(yǎng)料15 kg，面積為0.15 m2，每個(gè)菌株均3次重復(fù)，在床架上按隨機(jī)區(qū)組排列。

(2)復(fù)篩

以床架式栽培進(jìn)行出菇試驗(yàn)，每區(qū)面積1 m2，投二次發(fā)酵好的糞草培養(yǎng)料60 kg，每菌株4次重復(fù)。

(3)中型生產(chǎn)試驗(yàn)

于2010年～2011年產(chǎn)季在長(zhǎng)樂(lè)市鶴上鎮(zhèn)希爾帆食用菌有限公司進(jìn)行中型生產(chǎn)試驗(yàn)，菇房為永久性紅磚房，采用2次發(fā)酵層架式栽培，中試栽培面積為每個(gè)菌株300 m2，設(shè)置在同一座菇房，3次重復(fù)，每個(gè)菌株的培養(yǎng)料投料量與配方相同，堆料、后發(fā)酵、播種、復(fù)土?xí)r間同步，水份及通風(fēng)管理按常規(guī)進(jìn)行。

在初篩、復(fù)篩及中試生產(chǎn)試驗(yàn)過(guò)程中，分別觀察不同菌株的菌絲生長(zhǎng)速率、栽培特性和產(chǎn)質(zhì)量性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 選育過(guò)程

以酯酶同工酶為遺傳標(biāo)記，從供試異核體親本As2796和02分離出的同核不育菌株，通過(guò)配對(duì)雜交，獲得雜交種。其中W192菌株是由02分離的同核不育株02－286和As2796分離的同核不育株2796－208配對(duì)雜交獲得雜交種 (圖1)。

2.2 生物學(xué)特性

2.2.1 溫度適應(yīng)性

菌株W192菌絲生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)結(jié)果表1。

表1 W192菌絲生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)結(jié)果

溫度試驗(yàn)結(jié)果表明，雜交新菌株W192的菌絲生長(zhǎng)溫度范圍為10℃～35℃，適宜生長(zhǎng)溫度為25℃，致死溫度為35℃。

3.2.2 培養(yǎng)基含水量適應(yīng)性

菌株W192菌絲生長(zhǎng)濕度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 W192菌絲生長(zhǎng)濕度試驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)基不同含水量試驗(yàn)結(jié)果表明，雜交新菌株192的菌絲生長(zhǎng)的適合范圍為50%～70%，適宜生長(zhǎng)的范圍為50%～65%。

3.2.3 pH值適應(yīng)性

菌株W192菌絲生長(zhǎng)平板pH值試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 W192菌絲生長(zhǎng)平板pH值試驗(yàn)結(jié)果

平板pH值試驗(yàn)結(jié)果表明，雜交新菌株W192的菌絲在PDA平板上生長(zhǎng)的pH范圍為5～9，適宜生長(zhǎng)平板pH為7。

2.3 同工酶分析

菌株同工酶分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

雜交新菌株W192的酯酶同工酶表型為HG5型，呈典型的雜合態(tài)，但與親本As2796雜合態(tài)表型存在明顯的差別，其中標(biāo)記帶A、B是W192特有的酶帶。

2.4 栽培特性

2.4.1 初篩

雜交菌株與對(duì)照品種產(chǎn)量、質(zhì)量對(duì)比情況見(jiàn)表4。

表4 雜交菌株與對(duì)照品種產(chǎn)量、質(zhì)量對(duì)比

雜交菌株出菇品比試驗(yàn)結(jié)果表明，有5株比對(duì)照As2796長(zhǎng)滿培養(yǎng)料時(shí)間快1 d～2 d，采菇時(shí)間提早1 d～2 d，產(chǎn)量與高產(chǎn)親本品種02接近，其中W192產(chǎn)量比對(duì)照As2796提高23.5%，粒重與對(duì)照的優(yōu)質(zhì)親本As2796相當(dāng)，統(tǒng)計(jì)分析顯示雜交新菌株菌株產(chǎn)量與對(duì)照菌株As2796相比差異達(dá)到極顯著水平。

2.4.2 復(fù)篩

部分雜交菌株與對(duì)照品種產(chǎn)量、質(zhì)量對(duì)比情況見(jiàn)表5。

表5 部分雜交菌株與對(duì)照品種產(chǎn)量、質(zhì)量對(duì)比

上述優(yōu)選出的5株雜交新菌株經(jīng)過(guò)復(fù)篩，品比試驗(yàn)的結(jié)果表明，雜交新菌株與對(duì)照As2796產(chǎn)量相比均有較大提高，而粒重與對(duì)照的優(yōu)質(zhì)親本As2796相當(dāng)，其中W192產(chǎn)量提高20%，統(tǒng)計(jì)分析顯示雜交新菌株產(chǎn)量與對(duì)照菌株As2796相比差異達(dá)到極顯著水平。

2.4.3 中試生產(chǎn)試驗(yàn)

不同菌株生長(zhǎng)發(fā)育情況見(jiàn)表6。

表6 不同菌株生長(zhǎng)發(fā)育情況

雙孢蘑菇新品種W192菌絲生長(zhǎng)為貼生類(lèi)型菌絲，W2000菌絲生長(zhǎng)為半貼生類(lèi)型，As2796是氣生型菌絲。由表6可見(jiàn)，在栽培種麥粒培養(yǎng)基上，3個(gè)品種均為30 d左右透瓶。在床面培養(yǎng)料吃料走菌時(shí)間快1 d～2 d，新菌株W192、W2000爬土能力強(qiáng)，出菇時(shí)間比As2796快2 d～3 d，出菇潮次比較明顯。各菌株產(chǎn)量比較情況見(jiàn)表7。

表7 各菌株產(chǎn)量比較

由表7可見(jiàn)，從2010年12月12日開(kāi)始采收雙孢蘑菇到2011年4月12日結(jié)束。各菌株產(chǎn)量分別為W192雙孢蘑菇總產(chǎn)量 3 168.5 kg、平均單產(chǎn) 10.56 kg·m－2，W2000總產(chǎn)量3 048.3 kg、平均單產(chǎn)10.16 kg·m－2，As2796總產(chǎn)量2 634.7 kg，平均單產(chǎn)8.78 kg·m－2;W192、W2000兩菌株分別比對(duì)照菌株As2796增產(chǎn)20.2%和15.7%，質(zhì)量與As2796相當(dāng)(圖3～圖6)。

3 討論

雙孢蘑菇的新品種選育主要采取雜交育種技術(shù)，應(yīng)用雜交菌株與其親本進(jìn)行回交，可進(jìn)一步提高雜交菌株的產(chǎn)量。本文通過(guò)雜交菌株As2796與其高產(chǎn)親本02的不同配對(duì)雜交組合篩選試驗(yàn)，獲得一系列高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株，雜交菌株在產(chǎn)量上比As2796均有大幅度的提高。

雜交新菌株W192菌絲形態(tài)表現(xiàn)為貼生類(lèi)型，通過(guò)PDA培養(yǎng)基的多次轉(zhuǎn)管，菌絲形態(tài)表現(xiàn)穩(wěn)定，在麥粒培養(yǎng)基上也不會(huì)出現(xiàn)菌被，適合于塑料無(wú)菌透氣袋菌種的生產(chǎn)。

雜交新菌株W192適用于經(jīng)二次發(fā)酵的糞草料栽培，表現(xiàn)出耐肥、耐水和適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，要求每平方米投料量30 kg～35 kg，C∶N≈(28～30)∶1，含氮量 1.5%～1.6%，含水量65%～68%，pH值在7左右，正常管理的噴水量不少于高產(chǎn)菌株。菌種播種后萌稍慢，菌絲吃料速度中等偏快，生長(zhǎng)強(qiáng)壯有力，抗逆性較強(qiáng)，不易出現(xiàn)菌被。菌絲爬土速度中等偏快，紐結(jié)能力強(qiáng)，生長(zhǎng)快，因此開(kāi)采時(shí)間比As2796早1 d～2 d。該菌株基本單生，成菇率高，1潮～4潮產(chǎn)量較多，轉(zhuǎn)潮比較明顯，該菌株不宜薄料栽培，料含氮量太低或水分不足都會(huì)影響產(chǎn)量或產(chǎn)生薄菇和空腹菇等質(zhì)量不良現(xiàn)象。

[1]王澤生.雙孢蘑菇雜交育種研究進(jìn)展[J].中國(guó)食用菌，1992，11(4):10－12.

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[3]Wang ZS，Liao JH.Study on the crossbreeding techniques of Agaricus bisporus [J].Microl.Neotrop.，1990(3):1－12.

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[5]Wang ZS，Liao JH，Li FG，et al.Studies on the genetic basis of esterase isozyme loci Est A，B and C in Agaricus bisporus[J].Mushroom Science，1991，13(1):3－9.

[6]王澤生.應(yīng)用同工酶電泳法分析雙孢蘑菇白色菌株間的種內(nèi)親緣關(guān)系 [J].福建食用菌，1991，1(2):20－25.