袁勝東，羅 霞，余夢瑤，魏 巍，江 南，許曉燕，鄭林用

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學院，四川 成都 610066;2.四川省中醫(yī)藥科學院中藥與細胞分子生物學實驗，四川 成都 610041;3.四川省萬源市科學技術局，四川 成都 636350)

猴頭菌Hericium erinaceus是著名的食 (藥)用真菌，素有“蘑菇之王”的美稱。猴頭菌需分泌木質(zhì)纖維素酶類對木質(zhì)纖維素進行降解，以生成還原糖類小分子物質(zhì)才能被菌絲吸收利用。食用菌的酶學研究在上世紀70年代至90年代研究的較多，其中以日本科學家關于香菇的酶學研究最多，也取得了大量的成果，發(fā)現(xiàn)食用菌酶活的變化規(guī)律與其生長進程有著緊密的聯(lián)系，還指出漆酶對子實體形成具有調(diào)控作用[2]。在食用菌營養(yǎng)生理方面，也發(fā)現(xiàn)基質(zhì)內(nèi)葡萄糖的變化和食用菌生長進程相關。但目前所作研究主要集中在食用菌不同生長階段，將基質(zhì)內(nèi)物質(zhì)視為均勻整體對其物質(zhì)及酶活變化進行測定，還未查閱到關于基質(zhì)內(nèi)不同部位在生長不同時期的酶活及物質(zhì)研究方面的報道。將基質(zhì)視為均勻整體忽略了在基質(zhì)內(nèi)部菌絲體可能處于不同生理階段和不同分化程度，以及基質(zhì)營養(yǎng)狀態(tài)的差異。本文針對這一不足從空間和時間兩個維度全面地研究了猴頭菌基質(zhì)內(nèi)還原糖含量和木質(zhì)纖維素酶酶活變化，以了解基質(zhì)內(nèi)部在不同時期代謝情況。同時結(jié)合木質(zhì)纖維素酶酶活和還原糖含量之間的相關性研究找出酶活變化與生長發(fā)育相關的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 供試菌種

猴頭菌HE－3，由四川省中醫(yī)藥科學院細胞與分子生物學實驗室提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

1.2.1 母種活化培養(yǎng)基 (馬鈴薯綜合培養(yǎng)基)

馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、瓊脂20 g，水100 mL，pH自然。

1.2.2 原種培養(yǎng)基

棉籽殼78%、麥麩20%、蔗糖1%、石膏1%，含水量60%。

1.2.3 栽培基質(zhì) (栽培料)基本成分

棉籽殼79%、麥麩20%、石膏1%，含水量62%。

1.3 培養(yǎng)方法及條件

栽培料加水混勻后堆料過夜，次日裝袋 (菌袋規(guī)格14 cm×28 cm)，每袋濕重約570 g，高約為12 cm。于121℃滅菌2 h，冷卻后接原種。

菌袋在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，菌絲滿袋后移入菇棚，菇棚溫度16℃～24℃，濕度65%～80%。

1.4 取樣

如圖1、表1所示取樣。在菌絲長至菌袋1/4、1/2、3/4、滿袋、滿袋后第5天、原基出現(xiàn)、子實體生長第4天、子實體生長第8天、采收、采收后第5天這10個時期取樣，編號1～10;取樣時基質(zhì)從上至下分為4等分，編號Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ?？瞻讓φ諡槲唇臃N前基質(zhì) (編號0)。每次取3袋，按相同部位混勻，共取35個樣品，取樣后－80℃保存。

表1 取樣表

1.5 酶活及物質(zhì)含量測定

1.5.1 粗酶液提取

精確稱取2 g樣品，適當研磨后裝入具塞三角瓶中，加水20 mL，于30℃水浴鍋中浸提2 h，4層紗布過濾，濾液定容至25 mL，8 000 r·m－1、12℃，離心10 min，上清液即為粗酶液，EP管分裝，－80℃保存。

1.5.2 木質(zhì)纖維素酶酶活測定

漆酶酶活測定參照饒慶隆[1]的方法，每分鐘氧化1 μmol ABTS所需的酶量為1個酶活單位，樣品重復測定2次，得2次平均值;羧甲基纖維素酶酶活測定參照周長青[2]的方法，每克干樣30 min降解羧甲基纖維素納生成1 mg葡萄糖為1個酶活力單位;半纖維素酶酶活測定參照李江華等[3]的方法，每克干樣10 min降解木聚糖生成l mg木糖為1個酶活性單位。

1.5.3 還原糖含量測定

還原糖含量測定參照周長青[2]的方法，重復測定3次，得3次平均值。

1.5.4 pH測定

參照《土壤農(nóng)化分析手冊》土壤的氯化鉀鹽浸提液pH(潛在酸)的測定[4]，由于菌質(zhì)吸水性強，用1∶1(W∶V)浸提時液體被菌質(zhì)完全吸收，故本研究用50 mL KCl浸提25 g菌質(zhì)。

1.5.5 數(shù)據(jù)分析

采用Spss19.0軟件進行相關性分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 木質(zhì)纖維素酶酶活

2.1.1 漆酶酶活

漆酶酶活變化如圖2，其中“0”號樣品沒有檢測到酶活(圖上未顯示)。

圖2 漆酶酶活

從圖2看出，不同位置基質(zhì)的酶活在整個生長過程的變化趨勢基本一致，即在菌絲剛長滿基質(zhì)時酶活較高隨后活性降低到一定水平，在采收后酶活有所上升;其中部位Ⅰ的變化趨勢有所不同，在原基形成時酶活急劇升高出現(xiàn)一個活性高峰。

2.1.2 羧甲基纖維素酶酶活

羧甲基纖維素酶酶活變化如圖3，其中“0”號樣品沒有檢測到酶活 (圖上未顯示)。

圖3 羧甲基纖維素酶酶活

由圖3可看出，不同部位基質(zhì)酶活變化趨于一致，在營養(yǎng)生長階段酶活較低，呈緩慢上升趨勢，原基形成時形成一個活性小高峰，此后酶活略微下降，到采收時酶活達到最高，采收后酶活降低。其中部位Ⅰ的酶活在整個生長階段都要低于其他部位。

2.1.3 半纖維素酶酶活

半纖維素酶酶活變化如圖4，其中“0”號樣品沒有檢測到酶活 (圖上未顯示)。

圖4 半纖維素酶酶活

從圖4可以看出，半纖維素酶活與羧甲基纖維素酶酶活變化規(guī)律趨于一致。

2.2 還原糖含量

還原糖含量變化如圖5。

圖5 還原糖含量

從圖5可看出，基質(zhì)內(nèi)不同部位還原糖含量變化趨于一致，在菌絲剛長滿時含量較高，隨后含量逐漸降低，原基出現(xiàn)時含量達到低點，生殖生長階段還原糖含量逐漸增加，到接近采收及采收時含量達到一定峰值，采收后含量降低。其中部位Ⅳ基質(zhì)含量略高，部位Ⅲ、部位Ⅱ、部位Ⅰ基質(zhì)含量逐次降低，部位Ⅰ基質(zhì)在原基形成后還原糖含量升高趨勢有所不同，采收時含量超過其他樣品。

2.3 pH值

pH值如表2所示。

表2 PH

從表2可看出，基質(zhì)長滿菌絲后pH值從5.95降到4.6左右，各部位pH值相差不大且在不同時期變化不大，在生長后期pH值有所降低，采收后降到最低。

2.4 相關性分析

偏相關結(jié)果分析顯示，以半纖維素酶酶活和羧甲基纖維素酶酶活為控制變量，漆酶酶活與還原糖含量呈中度相關 (r=0.420，P=0.015);以半纖維素酶酶活和漆酶酶活為控制變量，羧甲基纖維素酶酶活與還原糖含量呈中度相關 (r=0.346，P=0.049);以羧甲基纖維素酶酶活和漆酶酶活為控制變量，半纖維素酶酶活和還原糖含量無顯著相關性;pH值與上述酶活無顯著相關性;羧甲基纖維素酶酶活與半纖維素酶酶活呈極顯著相關 (r=0.000，P=0.933)。

3 討論

基質(zhì)內(nèi)不同部位的木質(zhì)纖維素酶酶活和還原糖含量都有明顯的差異，在菌絲生長活躍的區(qū)域 (Ⅰ－1、Ⅱ－2、Ⅲ－3、Ⅳ－4)表現(xiàn)出了較強的漆酶酶活和較高的還原糖含量，說明在菌絲剛生成時木質(zhì)素降解反應活躍，生成了大量的還原糖以提供其營養(yǎng)需要。越靠近袋口的基質(zhì)表現(xiàn)出越低的酶活和較少的還原糖含量，部位Ⅰ基質(zhì)纖維素酶、半纖維素酶和還原糖含量都在相同時期基質(zhì)中數(shù)值最低。這可能是由于該部位最先長滿菌絲，菌絲自身老化或者該部位菌絲經(jīng)過分化轉(zhuǎn)為生殖生長進行著不同的代謝反應，也可能是由于基質(zhì)較早被酶分解利用導致基質(zhì)內(nèi)營養(yǎng)含量減少?；|(zhì)內(nèi)不同部位還原糖含量在生殖生長后期變化趨勢有所不同，最后呈現(xiàn)出上高下低的狀態(tài)，這可能與基質(zhì)內(nèi)部糖類轉(zhuǎn)移有關。

變化趨勢方面，基質(zhì)內(nèi)不同部位木質(zhì)纖維素酶酶活和還原糖含量變化趨勢基本相同，在猴頭生長發(fā)育的幾個重要時期都有明顯的變化:在菌絲剛長滿基質(zhì)時表現(xiàn)出較高的漆酶酶活和還原糖含量;幾種酶的酶活都在原基形成時出現(xiàn)活性高峰，還原糖含量在原基形成時含量降到最低谷;羧甲基纖維素酶、半纖維素酶以及還原糖含量都在采收時出現(xiàn)峰值。這些都說明木質(zhì)纖維素酶酶活和還原糖含量的變化與猴頭菌生長發(fā)育相關。其中漆酶酶活在原基出現(xiàn)時變化最為強烈，峰值最高，且該變化只出現(xiàn)在與原基形成位置直接相關的部位Ⅰ基質(zhì)，這也進一步說明漆酶與原基形成有著密切的聯(lián)系。采收后漆酶、羧甲基纖維素酶、纖維素酶酶活都有變化為營養(yǎng)生長階段的趨勢，為下個周期的原基形成做準備。

有報導顯示原基的形成與還原糖的大量消耗有關[5]，而還原糖是木質(zhì)纖維素酶類所催化反應的終產(chǎn)物，為了了解木質(zhì)纖維素酶酶活與還原糖含量的關系，對木質(zhì)纖維素酶酶活與還原糖含量進行了相關性分析。相關性分析顯示漆酶酶活、羧甲基纖維素酶酶活與還原糖含量呈中度相關，雖然半纖維素酶酶活與還原糖含量無顯著相關性，但半纖維素酶酶活與羧甲基纖維素酶酶活呈極顯著相關，半纖維素酶酶活能極大影響羧甲基纖維素酶酶活，這些說明了還原糖的生成受到了木質(zhì)纖維素酶的影響，進而對猴頭菌的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。

溫度和pH值對酶活影響較大，但本次試驗猴頭菌的營養(yǎng)生長階段在恒溫培養(yǎng)箱進行溫度穩(wěn)定，生殖生長階段在菇棚進行，溫度變化在16℃～24℃之間，變化不是很大且不可控，故本次試驗結(jié)果排除了溫度對酶活的影響。通過pH測定顯示樣品pH值在4.25～4.67之間變化，各部位pH值變化不大，相關性顯示pH值未能對酶活產(chǎn)生影響。

基質(zhì)內(nèi)不同部位木質(zhì)纖維素酶酶活和還原糖含量有較大的差異，排除pH和溫度可能對酶活的影響，提示基質(zhì)內(nèi)不同部位菌絲體可能處于不同的生理階段和分化程度，從而導致了代謝反應的差異。木質(zhì)纖維素酶和還原糖與猴頭菌生長發(fā)育密切相關，木質(zhì)纖維素酶可能通過調(diào)節(jié)基質(zhì)內(nèi)還原糖含量對猴頭菌生長發(fā)育產(chǎn)生影響，其中漆酶與猴頭菌原基形成聯(lián)系最為密切。

[1]饒慶隆.金針菇產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件研究 [D].南京農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文，2005:15－16.

[2]周長青.白靈菇栽培基礎生理和關鍵技術研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學博士學位論文，2007:46－50.

[3]李江華，房峻.半纖維素酶高產(chǎn)菌種的選育及產(chǎn)酶條件 [J].無錫輕工大學學報，2004，23(5):48－51.

[4]勞家檉.土壤農(nóng)化分析手冊 (第一版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1988.

[5]馮志勇.斑玉蕈對基質(zhì)中葡萄糖濃度變化的響應 [R].第九屆食用菌學術討論會學術報告.