陳李影慧，吳武佳，秦東春

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450052

肺癌是目前世界范圍內(nèi)由癌癥引起死亡的主要原因之一，其發(fā)病率和病死率逐年上升[1]。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)是一種NF-κB特異性抑制劑。近年來發(fā)現(xiàn)NF-κB有顯著的促細(xì)胞生長及抗凋亡作用，與細(xì)胞惡性化的關(guān)系密切。通過抑制NF-κB的活化，間接下調(diào)相關(guān)下游基因表達，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是一種有效的腫瘤治療方法[2-3]。新近發(fā)現(xiàn)，星形細(xì)胞上調(diào)基因-1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)過表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系[4]。作者觀察了PDTC對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡及AEG-1表達的影響，探究PDTC對A549細(xì)胞增殖的抑制作用及可能機制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料PDTC(純度為99%, 批號P8765)購自Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自北京索萊寶公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，DMSO、PI、Hoechst33342購自Sigma公司，MTT購自Biosharp公司，柱式Trizol總RNA抽提試劑盒及兔抗人AEG-1多克隆抗體(BBI)均購自上海生工生物工程有限公司，所需引物由上海生工生物工程有限公司合成，第一鏈合成試劑盒及2×Taq Green PCR Master Mix購自Fermentas公司，內(nèi)參β-actin一抗和羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。A549細(xì)胞由鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生學(xué)教研室惠贈。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3體外細(xì)胞增殖抑制實驗取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化，制成1×105L-1的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔200 μL。棄上清，對照組加入培養(yǎng)液，PDTC組加入PDTC，使終濃度分別為25、50、100和200 μmol/L，每組設(shè)5個復(fù)孔，在細(xì)胞孵育24、48、72 h后每孔分別加入5 g/L的MTT溶液 20 μL，孵育4 h，棄上清，加100 μL的DMSO，置于微量振蕩器上振蕩5 min，混勻，用酶聯(lián)免疫檢測儀測波長492 nm處的吸光度(A)值，實驗重復(fù)3次，取均值。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100%。以單純加入DMSO為空白組。

1.4細(xì)胞周期檢測取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以(1～2)×105mL-1的濃度接種于6孔板，每孔1 800 μL，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，每孔加入PDTC，使其終濃度分別為0(僅加入培養(yǎng)基)、25、50、100、200 μmol/L。培養(yǎng)24、48、72 h后，收集細(xì)胞，在PBS中吹打為單細(xì)胞懸液，體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇固定，4 ℃過夜。1 000 r/min離心10 min棄乙醇，PBS洗2次，每管加入750 μL PI染液,室溫避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.5細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞按1.4分組處理24 h后，收集細(xì)胞，PBS清洗2次，胰蛋白酶消化，用含體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清的培養(yǎng)基終止吹打成單細(xì)胞懸液，加入Hoechst33342至終濃度10 mg/L,37 ℃避光孵育30 min，制片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。

1.6AEG-1mRNA檢測PDTC作用24 h后，Trizol法提取6孔板內(nèi)各組細(xì)胞的總RNA。AEG-1上游引物：5’-AAATAGCCAGCCTATCAAGACTC-3’,下游引物：5’-TTCAGACTTGGTCTGTGAAGGAG-3’,擴增產(chǎn)物長度178 bp。內(nèi)參β-actin上游引物：5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’,下游引物：5’-TG GAAGGTGGACAGCGAGG-3’,擴增產(chǎn)物長度400 bp。按第一鏈合成試劑盒及2×Taq Green PCR Master Mix 的說明書進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。反應(yīng)體系：2×Master Mix(含染料)12.5 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物1 μL，ddH2O 9.5 μL，總25 μL。PCR擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55.2 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，UVP凝膠圖像分析儀掃描，目的條帶與內(nèi)參灰度值之比即為目的基因mRNA的相對表達量。

1.7AEG-1蛋白檢測裂解PDTC作用24 h后各組細(xì)胞并提取總蛋白，分光光度計測定蛋白濃度，取50 μg樣品蛋白分別經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為3.5%濃縮膠和100 g/L SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。用含50 g/L脫脂奶粉的TBST液室溫封閉1 h，然后置于用封閉液稀釋的兔抗人AEG-1多克隆抗體(按1600稀釋)和兔抗β-actin(按1400稀釋)中，4 ℃過夜。TBST洗膜，加入羊抗兔二抗(按12 000稀釋)搖晃孵育1.5 h，TBST洗膜后，ECL發(fā)光5 min，膠片曝光，結(jié)果掃入凝膠成像系統(tǒng)并分析。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用3×5析因設(shè)計的方差分析比較不同作用時間和不同濃度的PDTC作用24 h對A549細(xì)胞增殖的影響，采用單因素方差分析比較不同濃度的PDTC對A549細(xì)胞細(xì)胞周期、凋亡及AEG-1 mRNA和蛋白表達水平的影響，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1PDTC對A549細(xì)胞增殖的影響結(jié)果(表1)顯示：PDTC在25～200 μmol/L范圍內(nèi)對A549細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，且抑制作用呈劑量、時間依賴性。

2.2PDTC對A549細(xì)胞細(xì)胞周期的影響PDTC處理24 h后，G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期及G2/M期細(xì)胞比例降低。見表2。

2.3PDTC對A549細(xì)胞凋亡的影響A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度PDTC作用24 h后，Hoechst 33342染色見典型的細(xì)胞核凝聚特征并出現(xiàn)凋亡小體；對照組細(xì)胞染色后無此特征。見圖1。

表1 不同濃度PDTC作用不同時間A549細(xì)胞的增殖抑制率 %

F時間=531.981，F(xiàn)濃度=388.475，F(xiàn)交互=9.010，P均<0.001。

表2 PDTC作用24 h后A549細(xì)胞周期的分布 %

圖1 5組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(Hoechst 33342染色,×400)

2.4PDTC對A549細(xì)胞AEG-1mRNA和蛋白表達的影響見圖2、3，表3。結(jié)果顯示，PDTC作用后A549細(xì)胞AEG-1 mRNA和蛋白表達量均降低，呈明顯的劑量依賴關(guān)系。

圖2 5組細(xì)胞AEG-1 mRNA的表達

圖3 5組細(xì)胞AEG-1蛋白的表達

表3 5組細(xì)胞AEG-1 mRNA和蛋白的表達

*:兩兩比較，P均<0.05。

3 討論

NF-κB廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，其作為一種重要的多功能核轉(zhuǎn)錄因子，在人體免疫、炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。研究[5]表明NF-κB具有抗凋亡作用，NF-κB過表達可促進細(xì)胞的無限增殖，促使腫瘤的發(fā)生發(fā)展。體外實驗[6]研究發(fā)現(xiàn)，阻斷NF-κB活性可抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

PDTC為一種強抗氧化劑，是NF-κB特異性抑制劑，主要通過抑制NF-κB P65亞單位或抑制IκB的降解，減少NF-κB的核移位來抑制NF-κB活性[7]。體外實驗[8-10]表明PDTC對多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，主要表現(xiàn)在抑制增殖、促進凋亡和對化療藥物增敏等方面。該研究選用PDTC作用于A549細(xì)胞，結(jié)果顯示，PDTC能有效抑制A549細(xì)胞增殖并致G0/G1期阻滯，S及G2/M期相應(yīng)縮短，誘導(dǎo)凋亡,提示PDTC可通過抑制NF-κB活性抑制肺癌細(xì)胞的生長，其機制可能與PDTC阻斷NF-κB的抗凋亡途徑有關(guān)。

AEG-1基因位于8q22，全長3 611 kb，包含12個外顯子和11個內(nèi)含子，編碼582個氨基酸的蛋白質(zhì)；最初是從人胚胎星形膠質(zhì)細(xì)胞克隆得到[11-12]。AEG-1作為新發(fā)現(xiàn)的基因,其正常的生理功能尚不清楚。近年研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，AEG-1與一些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療密切相關(guān)，AEG-1在大部分正常及良性病變組織中表達水平非常低甚至不表達，而在多數(shù)惡性腫瘤組織中呈高表達。 AEG-1作為Ras-PI3K/Akt-GSK3-c-Myc的下游基因，能夠調(diào)節(jié)PI3K/Akt、NF-κB、Wnt/catenin、MAPK、AMPK/mTOR等多條與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子信號途徑，從而參與正常細(xì)胞癌變、腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤組織血管生成、腫瘤細(xì)胞保護性自噬、化療耐藥等眾多環(huán)節(jié)。該實驗證明應(yīng)用PDTC作用24 h后，隨著藥物劑量增加，A549細(xì)胞內(nèi)AEG-1 mRNA相對表達量和AEG-1蛋白表達量均逐漸下降。提示PDTC能抑制AEG-1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，進而可能影響腫瘤細(xì)胞的生長，但其具體機制有待進一步深入研究。

綜上所述，PDTC對A549細(xì)胞具有顯著的體外增殖抑制作用并可改變細(xì)胞周期的分布，誘導(dǎo)凋亡，此過程伴隨有AEG-1基因的表達下調(diào)，提示PDTC可能通過抑制NF-κB活性、下調(diào)AEG-1的表達，最終促使腫瘤細(xì)胞凋亡。

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