劉長(zhǎng)海，華春秀，歸改霞，劉錦輝，李賀文，夏西超#

1)南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 南陽(yáng) 473058 2)南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)院 南陽(yáng) 473061

中藥厚樸具有消除胸腹?jié)M悶、止痛、健胃、止咳、祛除水毒、活血化瘀等作用[1-2]。和厚樸酚(honokiol，HNK)是中藥厚樸的主要化學(xué)成分，屬于聯(lián)苯酚類化合物[3-4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，HNK具有抗炎[5]、降低膽固醇[6]、抗衰老[7]、誘導(dǎo)凋亡[8]等多種藥理作用，但關(guān)于HNK在肝損傷中的保護(hù)作用未見(jiàn)報(bào)道。四氯化碳(CCl4)能通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化引起肝細(xì)胞壞死[9]、脂變性及反應(yīng)性增生[10]，CCl4肝損傷模型常用作篩選具有保肝和治療肝病作用的藥物模型[11]。作者擬在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型基礎(chǔ)上探討HNK對(duì)肝損傷是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物來(lái)源及分組昆明種小鼠50只(購(gòu)自武漢大學(xué)，清潔級(jí))，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2) g。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為HNK (購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司)高、中、低劑量組(分別以20.0、2.0、0.2 mg/kg劑量皮下注射HNK注射液)，正常組和模型組(2組注射等量生理鹽水)5組，每組10只，均給藥1次/d，連續(xù)6 d，記錄給藥期間小鼠的攝食量和飲水量。第7天給藥2 h后，模型組和HNK高、中、低劑量組小鼠腹腔注射含體積分?jǐn)?shù)0.25% CCl4的大豆油溶液(10 mL/kg)，正常組注射等體積大豆油溶液，禁食，自由飲水，24 h后摘除眼球取血，制備血清；解剖肝臟，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2肝臟病理學(xué)觀察采用HE染色方法觀察大鼠肝臟病理學(xué)變化，即肝臟組織的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)、肝小葉及間質(zhì)有無(wú)異常。

1.3肝功能指標(biāo)檢測(cè)采用日本奧林巴斯AU2700型自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)和血糖(Glu)的含量。相關(guān)試劑購(gòu)自上海榮盛生物技術(shù)有限公司。

1.4血清中ALT、AST、ALPmRNA以及肝臟組織中TNF-α、IL-6和IFN-γmRNA的檢測(cè)用RNAiso Plus(TaKaRa公司)提取小鼠血清及肝臟組織總RNA，檢測(cè)證實(shí)總RNA的完整性和純度均符合實(shí)驗(yàn)要求。由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成各目的基因和內(nèi)參基因β-actin引物(表1)。按照PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa公司)操作說(shuō)明合成cDNA。反應(yīng)體系：5×PrimeScriptTMBuffer 2 μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer (50 μmol/L) 0.5 μL，總RNA 100 ng。反應(yīng)條件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。使用ABI7500型 real-time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系(20 μL)：SYRB Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)10 μL，PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ROX Reference Dye(TaKaRa)0.4 μL，dH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s， 40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔct進(jìn)行分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析比較各組小鼠血清中ALT、AST、ALP含量及mRNA水平和Glu濃度、肝臟組織中TNF-α、IL-6 和IFN-γ mRNA表達(dá)的差異，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

表1 引物及序列

2 結(jié)果

2.1各組小鼠肝組織病理學(xué)變化正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整；細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色，肝細(xì)胞呈索狀結(jié)構(gòu)排列，分界清晰，大小較均一，核圓而清晰，位于細(xì)胞中央，未見(jiàn)脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)。模型組肝細(xì)胞失去正常的索狀結(jié)構(gòu)，肝索排列紊亂，細(xì)胞索之間纖維細(xì)胞增生，中央靜脈變形；肝細(xì)胞腫脹并呈泡狀脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)充滿大小不等的圓形脂滴；小葉內(nèi)點(diǎn)、灶狀肝細(xì)胞壞死，伴淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B)。HNK各劑量組上述變化均有不同程度減輕，尤以HNK高劑量組變化最明顯(圖1E)。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)變化(HE,×400)

2.2各組小鼠血清中ALT、AST、ALP和Glu比較見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清中ALT、AST、ALP和Glu比較(n=10)

*：與正常組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05。

2.3各組小鼠肝臟組織中TNF-α、IL-6和IFN-γmRNA表達(dá)的比較見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠肝臟組織中

*：與正常組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05。

3 討論

肝損傷是由多因素參與的復(fù)雜病理過(guò)程，在此過(guò)程中，多種酶的表達(dá)發(fā)生重大變化，其中ALT、AST和ALP是用來(lái)衡量肝損傷與否及程度的常用指標(biāo)[12-13]。

該研究發(fā)現(xiàn)，CCl4處理后，模型組小鼠肝臟和血清中ALT、AST和ALP表達(dá)量高于正常組，提示肝損傷造模成功。ALT、AST和ALP均為可溶性酶，肝臟中這些酶主要存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞受到破壞，細(xì)胞通透性增加，這些酶迅速釋放，血清中ALT、AST和ALP的含量隨之升高[14]。由此，這些酶表達(dá)水平的高低能直接反映肝細(xì)胞損傷與否及損傷程度。病理學(xué)變化顯示，與模型組相比，HNK高、中、低劑量組肝細(xì)胞損傷減輕；同時(shí)血清ALT、AST和ALP的表達(dá)水平均有不同程度降低，其中以高劑量組變化最明顯，提示HNK能提高肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，增強(qiáng)肝細(xì)胞抗損傷能力，對(duì)肝損傷有一定的保護(hù)作用，且以高劑量組效果較好。

HNK處理后，肝臟中ALT、AST和ALP的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)和血清中對(duì)應(yīng)的酶活性水平降低有不一致現(xiàn)象，提示這些酶在肝臟中從轉(zhuǎn)錄下調(diào)到血液對(duì)應(yīng)酶活性的降低有一個(gè)復(fù)雜的加工過(guò)程，如基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控和翻譯水平的調(diào)控。該研究結(jié)果顯示，HNK對(duì)ALT、AST和ALP表達(dá)下調(diào)強(qiáng)度也不一樣，提示一方面可能與HNK調(diào)控路徑有關(guān)；另一方面，可能與靶基因?qū)NK具有劑量依賴性。該研究中的形態(tài)學(xué)變化間接反映了該現(xiàn)象。

肝臟的損傷和保護(hù)與其他組織相似，由促炎因子和抗炎因子的共同調(diào)控來(lái)完成。在促炎因子的表達(dá)受到抑制，抗炎因子發(fā)揮主導(dǎo)作用的情況下，有助于損傷的修復(fù)，增強(qiáng)機(jī)體的保護(hù)作用[10,15-16]。HNK處理后可抑制急性肝損傷模型中促炎關(guān)鍵因子TNF-α、IL-6 和IFN-γ表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)作用。還有研究[17-18]報(bào)道，促進(jìn)糖元合成，減少糖異生是預(yù)防和治療肝損傷的重要措施。作者的研究結(jié)果顯示，HNK還具有降低血糖的作用，尤其是高劑量組，提示HNK對(duì)肝臟保護(hù)作用是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，其具體的作用機(jī)制有待更深入的探究。

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