章海風 陳 敏 路新國 陸紅梅 (揚州大學營養(yǎng)系，江蘇 揚州 225001)

γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，約50%的中樞突觸部位是以GABA作為中樞傳導遞質(zhì)，通過其特異性受體介導，在控制神經(jīng)元興奮性方面發(fā)揮著重要作用，Diao等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)在貓的初級視皮層內(nèi)Glu-IR和GABA-IR的含量顯著下降，認為其可能是導致年齡相關性視功能衰退的重要因素。徐業(yè)華等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠與青年大鼠相比，視皮層GABA含量明顯下降。谷氨酸脫羧酶(GAD)是GABA的合成酶，γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T)可催化GABA與α-酮戊二酸之間的轉(zhuǎn)氨作用，生成琥珀酸半醛和谷氨酸，是GABA的代謝酶。根據(jù)前期的中醫(yī)方劑文獻統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，枸杞子和菊花是中醫(yī)眼科方劑中高頻用藥〔2〕，具有明目、抗氧化、抗衰老等功效。我們采用自然衰老大鼠模型，通過鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生反向高效液相色譜法對大鼠視皮層GABA含量進行檢測，同時測定GAD、GABA-T的活性，以期明確GABA的增齡性變化及杞菊提取液對其改善調(diào)節(jié)功效。

1 材料與方法

1.1 動物 56只清潔級SD大鼠〔許可證號為SCXK(蘇)2008-0004〕，其中3～4月齡大鼠16只，雌雄各半，為青年對照組;20～22月齡老年大鼠40只，雌雄各半。裂隙燈顯微鏡下排除眼疾個體。

1.2 藥物 枸杞菊花水提液制備:寧夏枸杞、汞菊按1∶1稱重，除雜后60℃干燥箱中干燥3 h，冷卻后，中藥粉碎機粉碎。固液比1∶10，80℃水浴浸提3 h，過濾，濾液再加5倍蒸餾水同法浸提2 h，合并濾液，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，最后用蒸餾水調(diào)至0.4 g/ml。按人與大鼠用藥比〔3〕設置0.5 g/kg(3.5倍)、1.0 g/kg(7倍)、2.0 g/kg(14倍)(生藥/大鼠體重)等低中高三個劑量組。4℃保存。明目地黃丸樣品液制備:明目地黃丸粉碎后按人用藥量7倍加入雙蒸水，80℃水浴溶解2 h，作為陽性對照組。4℃保存。

1.3 儀器與試劑 電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;電熱鼓風干燥箱(DGF30/7-IA)，南京實驗儀器廠;中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;優(yōu)普超純水系統(tǒng);數(shù)顯恒溫水浴箱(HH-8)，國華電器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52B)，上海亞榮生化儀器廠;超速高速冷凍離心機，貝克曼庫爾特公司;低速離心機;紫外可見分光光度計(Spectrumlab 755s)，上海棱光技術有限公司;PH計(PHS-3C)，上海精科儀器有限公司;裂隙燈顯微鏡(M339801)，北京中西遠大有限公司。寧夏枸杞、貢菊、明目地黃丸購自國藥控股江蘇有限公司，丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)及蛋白定量(雙縮脲法)測試盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 分組與處理 適應性飼養(yǎng)1 w后采用隨機分組法分成7組，每組8只，雌雄各半:A組:青年藥物組(中劑量提取液)，B組:青年陰性對照組(生理鹽水)，C組:老年陰性對照組(生理鹽水)，D1組:干預低劑量組(低劑量提取液)，D2組:干預中劑量組(中劑量提取液)，D3組:干預高劑量組(高劑量提取液)，E組:陽性對照組(明目地黃丸)。飼養(yǎng)于揚州大學醫(yī)學院動物房。飼養(yǎng)條件:環(huán)境溫度22～27℃，相對濕度50% ～70%，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。每組動物喂以標準飼料。采用灌胃給藥。給藥劑量1 ml/100 g(體重)，每天上午給藥1次，大鼠喂養(yǎng)5 w后稱重，拉頸椎處死，立即摘取左眼球，取下視皮質(zhì)(紋狀皮質(zhì)17區(qū)、18區(qū)、18a區(qū))，分別稱重，左腦加入9倍預冷的生理鹽水制成10%組織勻漿，離心(3 000 r/min×20 min)，取上清液用于測定視皮質(zhì)蛋白及GABA含量。右腦視皮層加入10倍冰冷的勻漿緩沖液(甘油 200 ml/L，TritonX-100 1.3 g/L，GSH 10－4mol/L，PLP 10－4mol/L，Na2EDTA 10－3mol/L，K2HPO4/KH2PO410－2，pH6.8)，勻 漿 后，離 心20 min，收集上清液用于GAD、GABA-T活性的檢測。

1.5 大鼠視皮質(zhì)中GABA含量、GAD與GABA-T活性檢測大鼠視皮質(zhì)中GABA含量測定:OPA柱前衍生反向高效液相色譜法。色譜分析條件:流動相為0.05 mol/L醋酸鈉:四氫呋喃:甲醇(50∶1∶49)調(diào)pH至4.3。該 流動相通過0.45 μm微孔濾膜過濾，真空脫氣后使用。柱溫(25±2)℃。流速為1 ml/min。熒光檢測器激發(fā)波長 337 nm，發(fā)射波長為454 nm。進樣量20 μl。標準品配制:將 GABA標準品用雙蒸水配制成0.009 375、0.018 75、0.031 25、0.075、0.15 μg/ml。衍生化試劑配制:OPA用色譜甲醇溶解，濃度為5 mg/ml，避光冷藏保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。處理分析:取樣品液(用前稀釋50倍)或標準品溶液500 μl，依次加入 OPA 衍生液 100 μl、硼酸鹽緩沖液(pH 9.9)375 μl、MPA 25 μl，旋渦混勻器混勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾后進樣，從加OPA到進樣控制在2 min內(nèi)。

大鼠視皮質(zhì)GAD活性檢測:比色法。200 μl底物溶液(10 mmol/L L-MSG 和0.1 mmol/L PLP)和 100 μl樣品液在30℃反應20 h，然后置于冰浴中，加入 200 μl硼酸緩沖液(pH9.0)終止反應，再加入1.0 ml 6%苯酚和400 μl次氯酸鈉(含活性氯5.25%)溶液，充分振蕩后，在沸水浴中反應10 min，迅速在冰浴中冷卻20 min，在630 nm測定吸光值，相對酶活力以單位時間內(nèi)每毫克蛋白A630值的變化表示，每組測定同時做3個重復，求平均值。

大鼠視皮質(zhì)GABA-T活性檢測:微量紫外比色法。取樣品勻漿上清30 μl加入到570 μl、pH8.75的磷酸緩沖液中(NAD+10－3mol/L，α-巰基乙醇 3.5 ×10－3mol/L)搖勻后再加入 20 μl底物溶液(α-酮戊二酸 4.8 mmol/L，GABA18 mmol/L)，30℃保溫15min，340nm比色測定生成物NADH濃度，GABA-T的活性以每min每mg蛋白樣品催化生成NADH的nmol數(shù)表示(nmol·min－1·mgprot－1)。所有操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件，計量數(shù)據(jù)以s表示;兩樣本比較采用成組t檢驗;多組間比較經(jīng)方差齊性檢驗方差齊后，用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 30 d飼養(yǎng)后，各組進食量和體重均無顯著差異(P＞0.05)，但從外表觀察，高劑量組和陽性對照組的大鼠皮毛較為稀疏，無光澤，個別大鼠出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，可能是年齡較大的個體差異。

2.2 杞菊提取液對大鼠視皮層GABA含量的影響 青年組GABA含量明顯高于老年組，青年藥物組明顯高于空白組(P＜0.01);老年中劑量組、高劑量組及陽性對照組GABA含量明顯高于老年空白組，差異性顯著(P＜0.01)，但低劑量組與空白組無顯著差異，低中高三個劑量組之間差異性顯著(P＜0.01)，陽性對照組的GABA含量接近中劑量組，高劑量組高于陽性對照組含量(P＜0.05)。說明枸杞菊花有提高大鼠視皮質(zhì)中GABA含量的作用，且高劑量組效果最優(yōu)。見表1。

2.3 杞菊提取液對大鼠視皮質(zhì)GABA-T的影響 青年組GABA-T值顯著低于老年組(P＜0.01)，青年藥物組顯著低于青年空白組(P＜0.01);老年低、中、高劑量組和陽性對照組顯著低于老年空白組(P＜0.01)，老年低劑量組顯著高于中高劑量組和陽性對照組(P＜0.01)，老年中高劑量組和陽性對照組之間則無顯著差異(P＞0.05)。說明老年大鼠視皮質(zhì)中的GABA-T活力較青年大鼠高，枸杞菊花有降低大鼠視皮質(zhì)中GABA-T活力的作用。且高劑量組效果最優(yōu)。見表1。

2.4 杞菊提取液對大鼠視皮質(zhì)GAD的影響 青年空白組(0.007 080±0.000 13)顯著高于其他6組(P＜0.01);與老年空白組(0.005 775±0.000 09)比較，低、中劑量組和陽性對照組 GAD活力上升(0.006 220±0.000 14，0.006 005±0.000 16，0.006 177±0.000 44，P＜0.01)，高劑量組(0.005 993±0.000 19)稍高于空白組，但無顯著差異，低劑量組顯著高于高劑量組(P＜0.01)。青年大鼠的視皮質(zhì)GAD值高于老年大鼠，枸杞菊花對老年大鼠視皮質(zhì)GAD值有不同程度的提高，其中以低劑量組效果最優(yōu)。

表1 各組大鼠視皮層中GABA的含量、GABA-T活性及GAD活性比較(n=8，s)

表1 各組大鼠視皮層中GABA的含量、GABA-T活性及GAD活性比較(n=8，s)

與B組比較:1)P＜0.01，與C組比較:2)P＜0.01，D1、D2、D3組間比較:3)P＜0.01，與D3組比較:4)P＜0.01

GABA(μg/g)108.54±1.66 91.08±3.35 61.74±6.43 65.95±3.111)2)3)75.30±3.412)3) 85.27±4.972)3) 76.79±4.524)GABA-T(nmol·min－1·mgprot－1)26.93±3.161) 36.21±2.75 66.44±2.251) 60.92±2.942)4) 51.96±2.632) 50.22±4.862) 52.77±4.442)

3 討論

隨著衰老，人及動物的視覺功能出現(xiàn)進行性衰退，表現(xiàn)為視銳度，減小、對視覺刺激的對比敏感度和波長的敏感性下降、對視覺刺激方位和運動方向的辨別能力下降以及對視覺信息的分析速度和計算效率降低。然而老年性視覺能力降低并非完全可以用眼的光學因素和視網(wǎng)膜老年性變化來解釋，由衰老引起的神經(jīng)中樞的結(jié)構(gòu)與生理功能變化可能在其中也起著重要作用。Schmolesky等〔3〕發(fā)現(xiàn)皮層內(nèi)GABA能系統(tǒng)抑制作用的減弱可能導致了老年性視覺方向與方位選擇性的降低。Katzner等〔4〕通過對貓局部的電離子透入療法后，記錄視皮層中選擇性GABA拮抗劑，發(fā)現(xiàn)視皮層中GABA抑制劑能有效幫助提高對視覺刺激的選擇性，通過調(diào)節(jié)他們獲得的反應來控制視皮層神經(jīng)細胞的敏感性。Leventhal等〔5〕發(fā)現(xiàn)，施加 GABA及GABAA受體激動劑可使老年猴視皮層細胞較大地恢復對視覺刺激的方位和運動方向選擇性，而對青年猴的作用要小得多。老年性GABA能系統(tǒng)退化可能不僅與其特異性受體表達量的減少有關，遞質(zhì)含量的降低也應該具有重要影響。本實驗結(jié)果顯示視覺皮層內(nèi)GABA抑制作用的減弱可能是引起視覺功能衰退的重要原因之一。

GAD和GABA-T分別是GABA的合成與分解酶，它們含量與活性的高低對于體內(nèi)GABA水平具有重要意義。衰老可能導致GAD的mRNA與蛋白表達量降低，活性下降，而GABA-T的表達量與活性都出現(xiàn)年齡相關性增加，這表明GABA的增齡性變化是由GAD與GABA-T協(xié)調(diào)控制的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，與青年大鼠相比，老年大鼠空白組視皮層中有GAD活性下降，GABA-T活性上升的現(xiàn)象，這可能是視皮層中GABA表達量隨年齡降低的直接原因。實驗還發(fā)現(xiàn)枸杞子和菊花提取液能夠降低GABA分解酶GABA-T的活性，提高合成酶GAD的活性，并具有一定的量效關系，從而推斷杞菊提取液可能對老年性視功能的衰退具有一定的改善作用。

同時，隨著年齡的增長，人體視功能會出現(xiàn)年齡相關性的衰退，除了藥物等相關治療，及早預防具有更大的意義。實驗還發(fā)現(xiàn)，杞菊提取液對青年大鼠視皮層中的GABA-T和GAD的活性也具有同樣的影響。中醫(yī)認為枸杞子味甘，性平，歸入肝、腎經(jīng)。能滋補肝腎，益精明目，為腎虛內(nèi)障之良藥?！侗静萁?jīng)疏》:“枸杞子，潤而滋補，兼能退熱，而專于補腎、潤肺、生津、益氣，為肝腎真陰不足、勞乏內(nèi)熱補益之要藥。老人陰虛者十之八九，故服食家為益精明目之上品?！本栈ㄎ陡士?，性微寒，歸入肺、肝經(jīng)。以疏風散熱、平肝明目著稱，為眼科常用藥。兩者都屬于衛(wèi)生部公布的既是食品又是藥品的范疇，因此，枸杞子和菊花可以作用一種保健食品長期的使用，對預防老年性視功能的衰退具有一定的功效。

綜上所述，杞菊提取液可提高大鼠視皮層GABA含量和GAD活性，降低GABA-T活性，從而改善或延緩老年視功能的衰退，并有一定的劑量效應關系。

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