王 鈺 劉學(xué)政 (遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

糖尿病患者皮膚抵抗能力極差，很易破損感染，加上糖尿病血管病變會(huì)導(dǎo)致患者局部組織缺血、缺氧，糖尿病神經(jīng)病變能導(dǎo)致患者局部感覺(jué)減退甚至消失而易于損傷。因此，糖尿病皮膚潰瘍是一種比較頑固的慢性潰瘍疾病，如果治療不及時(shí)就會(huì)向深部發(fā)展，最后甚至導(dǎo)致患者截肢，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量〔1，2〕。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)是體內(nèi)分布極為廣泛的生長(zhǎng)因子之一，與胰島素原高度同源，有促細(xì)胞分化和增殖活性，幾乎所有組織和細(xì)胞都能分泌，其生物學(xué)功能還可通過(guò)自分泌和旁分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)〔3，4〕。有實(shí)驗(yàn)證明IGF-1是參與創(chuàng)面炎癥反應(yīng)、肉芽組織增生以及再上皮化等主要過(guò)程的細(xì)胞因子之一，能夠提高創(chuàng)面愈合速率和愈合質(zhì)量〔5〕。本實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的外源性IGF-1對(duì)糖尿病大鼠皮膚潰瘍愈合的影響，旨在找到最佳濃度、性?xún)r(jià)比最高的IGF-1的濃度，為其應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 健康雄性Wistar大鼠，3月齡，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;IGF-1，上?？党缮锕こ逃邢薰?兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體、兔抗鼠MMP抑制物-1(TIMP-1)抗體，美國(guó)NEOMARKERS公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS;電子分析天平，上海方瑞儀器廠生產(chǎn)(A2104型);高壓蒸汽消毒鍋，上海博訊實(shí)業(yè)公司(GYZ-2000型);72型分光光度計(jì)，上海天普分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 分為對(duì)照組(n=5)、模型組(n=5)和實(shí)驗(yàn)組(n=20)，實(shí)驗(yàn)組再分成四組，給予不同濃度的IGF-1 0.5，1，1.5，2 mg/L。

1.2.2 糖尿病大鼠模型的制備 模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)60 mg/kg誘發(fā)糖尿病，48 h后當(dāng)大鼠血糖＞16.7 mmol/L時(shí)，認(rèn)為糖尿病模型制備成功〔6〕。造模過(guò)程中失敗的大鼠隨時(shí)給予補(bǔ)充，取20只造模成功的實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行皮膚潰瘍模型治療。

1.2.3 皮膚潰瘍樣本制備及干預(yù) 2 w后，于大鼠的背部人工制作2 cm×2 cm的方形創(chuàng)面，深達(dá)皮下組織，形成皮膚潰瘍創(chuàng)面〔7〕。皮膚創(chuàng)面形成后，將實(shí)驗(yàn)組的20只大鼠隨機(jī)均分為4組(n=5)，分別給予0.5、1、1.5、2 mg/L 的 IGF-1 進(jìn)行干預(yù)，每次每個(gè)創(chuàng)面給液量0.1 ml，對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水，無(wú)菌紗布包扎，隔日換藥，換藥時(shí)將無(wú)菌紗布揭開(kāi)，常規(guī)消毒后，創(chuàng)面均勻噴灑IGF-1溶液，然后再用無(wú)菌紗布包扎，持續(xù)換藥20 d。

1.3 主要觀察指標(biāo)

1.3.1 潰瘍面積 透明膜描記記錄傷后第5、10、15、20天創(chuàng)面面積，肉眼觀察肉芽組織生長(zhǎng)和再上皮化情況，創(chuàng)面愈合程度按照愈合率0～100%標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估，100%表示完全愈合。

1.3.2 電子顯微鏡及組織學(xué)觀察 第20天創(chuàng)面成纖維細(xì)胞及蘇木素-伊紅(HE)染色切片觀察毛細(xì)血管肉芽組織的生長(zhǎng)情況。于各時(shí)間點(diǎn)將各組創(chuàng)面區(qū)標(biāo)本做冰凍切片后，立即電子顯微鏡觀察成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況;其余標(biāo)本浸入中性多聚甲醛/磷酸鹽緩沖液(PBS)中固定、石蠟包埋、切片和脫蠟至水，進(jìn)行HE染色，觀察各組創(chuàng)面肉芽組織生成情況。

1.3.3 免疫組織化學(xué)鏈霉親合素-生物素復(fù)合物(SABC)法檢測(cè) MMP-9、TIMP-1〔8，9〕于創(chuàng)面損傷后第 5、10、15、20 天取潰瘍創(chuàng)面組織，體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定、脫水，石蠟包埋，進(jìn)行免疫組化染色測(cè)量MMP-9和TIMP-1的表達(dá)。每次染色均設(shè)有PBS(代替一抗)的陰性對(duì)照。圖像分析利用Leica圖像分析系統(tǒng)，在400倍視野下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)定陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的平均灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 潰瘍面積肉眼觀察 不同處理組治療后潰瘍狀況均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而縮小，其中對(duì)照組為自然愈合，好轉(zhuǎn)狀況較好，而糖尿病模型組愈合率最差;各給藥組創(chuàng)面大體觀亦有不同形式好轉(zhuǎn)，其中IGF-1質(zhì)量濃度為0.5、1.0 mg/L時(shí)效果一般，較模型組有好轉(zhuǎn)但不如正常愈合;而2.0 mg/L時(shí)，第5天效果最好，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，效果越來(lái)越差。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可見(jiàn)，劑量為1.5 mg/L IGF-1最為理想，且好于對(duì)照組。見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠皮膚創(chuàng)面損傷面積的比較(%)

2.2 電子顯微鏡觀察皮膚潰瘍創(chuàng)面的愈合情況

2.2.1 各組創(chuàng)面區(qū)肉芽組織形態(tài) 正常對(duì)照組大鼠正常愈合，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞，隨著愈合時(shí)間的增加炎性細(xì)胞減少，組織結(jié)構(gòu)變得清晰，基質(zhì)增加，毛細(xì)血管較多。模型組無(wú)論是成纖維細(xì)胞還是新生血管數(shù)目明顯偏少，但各實(shí)驗(yàn)組肉芽生長(zhǎng)迅速，可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞;成纖維細(xì)胞增殖活躍，聚集成群，胞質(zhì)豐富，輪廓較清晰，膠原纖維束排列密集而有序，愈合良好，可見(jiàn)大量毛細(xì)血管生成;但1.5 mg/L組成纖維細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)好于其他三組，2.0 mg/L組較0.5 mg/L和1.0 mg/L實(shí)驗(yàn)組愈合明顯提前，上皮覆蓋較明顯，但比1.5 mg/L組差，病理切片觀察愈合情況為1.5 mg/L組最好。見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色觀察皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合后肉芽組織(×200)

2.2.2 電鏡下觀察成纖維細(xì)胞的形態(tài) 正常對(duì)照組成纖維細(xì)胞規(guī)則分布，周?chē)梢?jiàn)膠原纖維，排列緊密;模型組少見(jiàn)成纖維細(xì)胞分布，周?chē)M織炎癥侵入。而實(shí)驗(yàn)組給予IGF-1干預(yù)后第20天可見(jiàn)成纖維細(xì)胞體積增大，細(xì)胞形態(tài)良好且規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線(xiàn)粒體、溶酶體、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器豐富，周?chē)梢?jiàn)大量膠原纖維，排列整齊、有序，說(shuō)明IGF-1可以促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，效果好于正常對(duì)照組。見(jiàn)圖2。

2.3 不同時(shí)點(diǎn)各組皮膚組織MMP-9/TIMP-1表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，糖尿病造模后皮膚傷口MMP-9表達(dá)水平顯著增高，均在第10天時(shí)達(dá)高峰，之后逐漸下降。IGF-1不同劑量組各數(shù)據(jù)結(jié)果均低于模型，證明應(yīng)用IGF-1可緩解皮膚潰瘍，隨著時(shí)間的增加，MMP-9表達(dá)水平均呈下降趨勢(shì)，0.5、1.0 mg/L時(shí)效果相近，2.0 mg/L時(shí)第5天達(dá)峰值，隨后下降，但仍高于對(duì)照組和1.5 mg/L組，可見(jiàn)大劑量給藥后能夠短暫地緩解皮膚潰瘍，不適于長(zhǎng)期應(yīng)用。證明1.5 mg/L是最佳給藥劑量。見(jiàn)表2。

在糖尿病造模后皮膚傷口TIMP-1表達(dá)顯著降低，在第10天時(shí)達(dá)峰值，之后逐漸下降，且低于對(duì)照組。隨著IGF-1治療劑量的增加，TIMP-1表達(dá)呈上升趨勢(shì)，劑量為0.5、1.0 mg/L組TIMP-1水平高于模型組，第5、10天時(shí)低于對(duì)照組，而第15、20天時(shí)雖然呈下降趨勢(shì)，但結(jié)果仍高于對(duì)照組;劑量為1.5 mg/L時(shí)，與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性意義;劑量為2.0 mg/L時(shí)第5、10天開(kāi)始效果顯著，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，各指標(biāo)恢復(fù)到0.5、1.0 mg/L組水平，三組比較無(wú)顯著性差異。證明1.5 mg/L是最佳給藥劑量。見(jiàn)表3。

圖2 電鏡觀察皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合后成纖維細(xì)胞形態(tài)(×15 000)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組MMP-9表達(dá)水平比較(s)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組MMP-9表達(dá)水平比較(s)

對(duì)照組 － 28.37±2.12 34.81±1.28 20.68±2.14 11.31±1.20模型組 － 26.25±1.33 37.17±2.42 32.38±1.24 25.21±2.13實(shí)驗(yàn)組 0.5 21.46±2.09 30.40±1.76 23.25±2.06 24.01±2.09 1.0 22.29±1.67 25.21±2.34 21.17±2.31 22.87±2.08 1.5 26.95±1.092)30.73±2.011)19.58±2.101)10.24±2.161)2.0 27.07±2.112)3.80±2.05 22.74±2.15 21.54±2.07

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組TIMP-1表達(dá)水平比較(s)

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組TIMP-1表達(dá)水平比較(s)

對(duì)照組 － 60.37±2.161)80.09±3.021)40.38±3.641)10.18±5.201)模型組 － 39.78±1.25 49.34±3.15 37.18±4.05 8.07±3.44實(shí)驗(yàn)組 0.5 49.38±2.25 60.44±2.47 45.18±3.23 20.35±2.04 1.0 50.68±3.02 68.57±3.11 44.27±2.24 18.09±3.01 1.5 58.25±3.121)78.63±5.071)41.31±2.531)12.18±3.161)2.0 62.52±2.69 73.50±2.14 46.27±3.15 17.06±2.14

3 討論

糖尿病皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，涉及創(chuàng)面炎癥反應(yīng)、肉芽組織增生以及再上皮化等主要過(guò)程，很多細(xì)胞因子參與和調(diào)控〔10〕。由各種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在正常傷口愈合中發(fā)揮著至關(guān)需要的作用。傷口的愈合包括炎癥反應(yīng)、上皮形成、新血管發(fā)生、基質(zhì)形成和膠原合成，最終傷口愈合。IGF是體內(nèi)重要的生長(zhǎng)因子，以自分泌、旁分泌等方式對(duì)組織細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，以及機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要的調(diào)節(jié)作用。

在創(chuàng)面愈合過(guò)程中，IGF-1發(fā)揮著重要的生理作用，其來(lái)源主要是創(chuàng)面以外來(lái)源的IGF-1，它與成纖維細(xì)胞增殖、活躍程度密切相關(guān)。傷口內(nèi)IGF-1表達(dá)量的變化與成纖維細(xì)胞和Ⅰ型膠原的變化相關(guān)，IGF-1與Ⅰ型膠原的分泌和創(chuàng)面愈合有著固有的內(nèi)在聯(lián)系，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的Ⅰ、Ⅲ型膠原是主要的間質(zhì)膠原，也是皮膚結(jié)締組織中的主要膠原類(lèi)型;它不僅能填充組織缺損，同時(shí)還為表皮細(xì)胞遷移提供支架，所以創(chuàng)面中成纖維細(xì)胞是否增生活躍直接影響著創(chuàng)面的愈合時(shí)間〔11，12〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IGF-1具有顯著促進(jìn)糖尿病大鼠背部潰瘍愈合的作用，表現(xiàn)為明顯減小創(chuàng)面面積，顯著提高愈合率并縮短平均愈合時(shí)間，促進(jìn)創(chuàng)面新生血管生成和肉芽組織生長(zhǎng)及再上皮化，進(jìn)而使肉芽組織生長(zhǎng)活躍，創(chuàng)面收縮與再上皮化明顯，效果接近并好于對(duì)照組。根據(jù)IGF可改善創(chuàng)面局部血液循環(huán)、促進(jìn)創(chuàng)面毛細(xì)血管再生、加速創(chuàng)面愈合的原理，目前已有很多相關(guān)藥物應(yīng)用于臨床。

MMPs在創(chuàng)面基質(zhì)降解和皮膚的重塑過(guò)程中具有重要作用，其與創(chuàng)面愈合纖維化、瘢痕形成和慢性創(chuàng)面愈合速度密切相關(guān)〔13〕。近年來(lái)的研究表明MMPs/TIMPs含量失調(diào)是形成慢性創(chuàng)面的重要因素。正常傷口愈合過(guò)程中，MMPs/TIMPs在清除壞死物、細(xì)胞遷移和細(xì)胞外基質(zhì)降解重塑過(guò)程中起著重要作用〔14〕。朱平等〔14〕研究認(rèn)為，正常皮膚的 MMP-9/TIMP-1 始終維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的穩(wěn)定水平，MMPs發(fā)生變化的同時(shí)其生理性拮抗劑TIMP也發(fā)生了相應(yīng)變化，這種平衡不但有利于局部傷口的修復(fù)，同時(shí)又防止了局部有關(guān)物質(zhì)的過(guò)度破壞和堆積。

本研究說(shuō)明，采用IGF-1治療糖尿病皮膚潰瘍是一種安全、有效的方法，可以明顯改善糖尿病皮膚潰瘍的愈合速率，提高愈合質(zhì)量。

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