易新萍，谷文喜，吳冬玲，李延濤，馬曉菁，葉 鋒，劉麗婭，薛 晶，鐘 旗

2.新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，烏魯木齊830032

布魯氏菌病（Brucellosis，簡(jiǎn)稱(chēng)布病）是由布魯氏菌（Brucella）引起的以感染家畜為主的人獸共患傳染病。布魯氏菌具有宿主廣泛、傳染性強(qiáng)以及感染后根治困難等特點(diǎn)，對(duì)畜牧業(yè)和人類(lèi)健康均構(gòu)成嚴(yán)重威脅。迄今該病已波及到世界各地，許多國(guó)家和地區(qū)都有人畜布魯氏菌病的存在和流行[1－3]。近幾年，我國(guó)布魯氏菌病的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，而帶菌的動(dòng)物是其他動(dòng)物和人類(lèi)布病的主要傳染源。因此，加強(qiáng)動(dòng)物布魯氏菌病的防控勢(shì)在必行，這對(duì)防控人間布病具有重要的意義[4]。在正確診斷和捕殺患病動(dòng)物切斷傳染源的基礎(chǔ)上，接種疫苗是公認(rèn)的能夠降低動(dòng)物布病發(fā)生和傳播的最實(shí)際、最有效的方法之一[5]。用于預(yù)防牛布魯氏菌病的A19疫苗在我國(guó)使用至今已有60余年，為有效地控制牛布病提供了重要保障，但同時(shí)也存在一定的缺陷。即A19疫苗缺乏鑒別診斷標(biāo)記，疫苗接種動(dòng)物與自然患病動(dòng)物無(wú)法甄別，造成布魯氏菌無(wú)法在畜群中根除，嚴(yán)重地影響了布魯氏菌病的診斷、檢疫。因此，研制具有診斷標(biāo)記的A19疫苗是布病疫苗研究的熱點(diǎn)之一[6－9]。

以我國(guó)A19疫苗為親本株，應(yīng)用同源重組技術(shù)敲除布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)中VirB12基因而成功構(gòu)建了A19－ΔVirB12突變株。本研究對(duì) A19－ΔVirB12突變株菌落形態(tài)、毒力、遺傳穩(wěn)定性、免疫原性等生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)了A19－ΔVirB12突變株的免疫效果，為動(dòng)物布魯氏菌分子標(biāo)記疫苗株的研制提供數(shù)據(jù)參考，以期布魯氏菌病綜合防治技術(shù)提供支持。

1 材料和方法

1.1 菌株 流產(chǎn)布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株2308、流產(chǎn)布魯氏菌疫苗株A19（B.abortusvaccine A19）和流產(chǎn)布魯氏菌標(biāo)記疫苗候選株A19－ΔVirB12，均由新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所細(xì)菌室構(gòu)建或保存。

1.2 試劑 Brucella Broth培養(yǎng)基（TSB）和 Brucella Agar（TSA）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司。布魯氏菌抗原及血清購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病研究所。PCR mix購(gòu)自北京莊盟生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB／c雌鼠購(gòu)自新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào)：SCXK（新）2003－0002。BALB／c雌鼠飼養(yǎng)于新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室的負(fù)壓隔離籠具中。

1.4 A19－ΔVirB12的培養(yǎng)特性 取布魯氏菌A19－ΔVirB12與A19純培養(yǎng)物在Brucella Agar培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，肉眼觀察菌落形態(tài)。革蘭氏染色法和柯茲洛夫斯基染色法染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)及染色情況。

1.5 血清凝集試驗(yàn) 分別將30μL A19－ΔVirB12抗原與布魯氏菌光滑型或粗糙型血清等量混合，反應(yīng)1～2min觀察抗原懸液與光滑型或粗糙型血清因子的凝集反應(yīng)情況。

1.6 變異檢查 對(duì)A19－ΔVirB12繼代菌株做結(jié)晶紫染色，同時(shí)將制備的A19－ΔVirB12抗原與0.1%吖啶黃染液各30μL等量混合，37。C反應(yīng)6h后取出置室溫，次日觀察菌體懸液的凝集情況，鑒定其是否發(fā)生變異。

1.7 傳代穩(wěn)定性

1.7.1 體外傳代試驗(yàn) 挑取A19－ΔVirB12單菌落接種于5mL TSB液體培養(yǎng)基中，37。C條件下180r／min培養(yǎng)36h后進(jìn)行變異檢查（結(jié)晶紫染色和吖啶黃凝集試驗(yàn)）和PCR鑒定[10]。取液體培養(yǎng)菌液按1∶100比例接種至新的TSB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)36h，再次對(duì)培養(yǎng)菌液進(jìn)行變異檢查及PCR鑒定，如此反復(fù)在體外傳至25代，觀察菌株 A19－ΔVirB12的體外傳代穩(wěn)定性。根據(jù)GenBank序列（AF226278）設(shè)計(jì)VirB12基因鑒別引物，即上游引物 （VirB12－F）5′－CGTCGGAACCG CTCTATA GGTC－3′，下 游 引 物 （VirB12－R）5′－GTCAGCTTCTCGCCAACACAAG－3′。

1.7.2 體內(nèi)傳代試驗(yàn) 選擇6周齡BALB／c鼠3只，接種疫苗候選株A19－ΔVirB12，劑量為5×104CFU／只。10d剖殺，無(wú)菌取其脾臟制備組織勻漿，涂布于TSA培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出菌落后并制備成菌懸液，將第2代接種物以上述方式繼代接種第2批BALB／c鼠。如此反復(fù)在BALB／c鼠體內(nèi)進(jìn)行傳代，并對(duì)各代次分離菌株與初代接種菌株進(jìn)行基因型和表型比較。

1.8 毒力測(cè)定 取6周齡雌性BALB／c小鼠20只，隨機(jī)分為2組，分別以10億CFU皮下接種A19和A19－ΔVirB12，15d剖殺取脾臟勻漿進(jìn)行細(xì)菌分離計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)每克脾臟載菌量以評(píng)價(jià)其毒力。

1.9 免疫保護(hù)力測(cè)定 取6周齡雌性BALB／c小鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只，并分別腹腔接種 A19、A19－ΔVirB12和PBS，參照文獻(xiàn)[11]，以5.0×104CFU／只劑量接種免疫。接種后第45d分別用布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株2308對(duì)各組小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，劑量為3.0×104CFU／只。攻毒后15d剖殺各組小鼠，取脾臟勻漿進(jìn)行細(xì)菌分離計(jì)數(shù)，SPSS 11.5軟件分析比較免疫組及PBS對(duì)照組中小鼠體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 A19－ΔVirB12的培養(yǎng)特性 在TSA培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，72h則可發(fā)現(xiàn) A19和 A19－ΔVirB12菌株均具有淡藍(lán)色、半透明的針尖大小菌落，且二者形態(tài)大小基本一致；95%以上的菌落屬光滑型，菌落邊緣整齊，圓潤(rùn)，露滴狀，微帶藍(lán)色乳光（圖1）。在TSB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)均勻，渾濁，不透明。

圖1 A19－ΔVirB12菌株的培養(yǎng)Fig.1 Culture of A19－ΔVirB12strain

2.2 菌落染色特性 將A19－ΔVirB12菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏和柯茲羅夫斯基染色并鏡檢鑒定。A19－ΔVirB12為球桿菌，單個(gè)散在，無(wú)鞭毛，不形成芽孢和莢膜。A19－ΔVirB12革蘭氏染色呈紅色，柯茲羅夫斯基染色的布魯氏菌呈紅色，背景為綠色（圖2，圖3）。

圖2 A19－ΔVirB12革蘭氏染色Fig.2 Gram staining of A19－ΔVirB12strain

圖3 A19－ΔVirB12柯茲羅夫斯基染色Fig.3 Cozy Roelfs Ki staining of A19－ΔVirB12strain

2.3 血清凝集實(shí)驗(yàn) 疫苗株A19與A19－ΔVirB12菌與光滑型菌株免疫動(dòng)物的血清凝集，與粗糙型菌株免疫血清不凝集反應(yīng)，表明A19和A19－ΔVirB12均具備光滑型布魯氏菌特性。

2.4 變異檢查 A19－ΔVirB12抗原與0.1%吖啶黃染液各30μL等量混合，37。C反應(yīng)6h后取出置室溫，次日觀察菌體懸液為均勻混濁狀態(tài)，表明A19－ΔVirB12為光滑型菌液。A19－ΔVirB12菌落結(jié)晶紫染色呈淺黃色，表明其菌落形態(tài)為光滑型。

2.5 傳代穩(wěn)定性

2.5.1 體外傳代 將 A19－ΔVirB12菌株用 TSB液體培養(yǎng)基體外連續(xù)傳至30代，取每代菌液及其固體培養(yǎng)基劃線接種物，通過(guò)吖啶黃凝集試驗(yàn)和菌落結(jié)晶紫染色試驗(yàn)檢測(cè)，各代次A19－ΔVirB12均不與吖啶黃溶液凝集，且結(jié)晶紫染色的菌落均勻一致，均呈淺黃色。以布魯氏菌VirB12基因?yàn)殍b定引物，分別每隔5代選取部分菌落進(jìn)行PCR鑒定，A19參考株P(guān)CR擴(kuò)增目的片段為713bp，A19－ΔVirB12突變株P(guān)CR擴(kuò)增目的片段為236bp。結(jié)果表明，A19－ΔVirB12突變株在體外傳代穩(wěn)定，缺失的VirB12基因沒(méi)有發(fā)生重組而重新恢復(fù)獲得VirB12基因（圖4）。

圖4 A19－ΔVirB12體外傳代的PCR鑒定Fig.4 Identification of A19－ΔVirB12 in vitro by PCR 1：The first generation of A19－ΔVirB12strain；2：The fifth generation of A19－ΔVirB12strain；3：The tenth generation of A19－ΔVirB12strain；4：The fifteen generation of A19－ΔVirB12strain；5：The twentieth generation of A19－ΔVirB12strain；6：The twenty－fifth generation of A19－ΔVirB12strain；7：Negative control；8：A19；M：DL2000DNA marker.

2.5.2 體內(nèi)傳代 將剖殺的BALB／c鼠脾臟分離布魯氏菌，按照2.5.1中PCR方法對(duì)各代次分離的細(xì)菌進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明從BALB／c鼠脾臟分離的每代A19－ΔVirB12株擴(kuò)增目的條帶為236bp，均缺失VirB12部分基因，結(jié)果見(jiàn)圖5。

2.6 毒力測(cè)定 表1結(jié)果表明A19－ΔVirB12突變株每克脾臟含菌量低于1.0×106CFU，為弱毒株。相比較于A19株，A19－ΔVirB12在BALB／c鼠的克脾菌數(shù)低于A19，表明A19－ΔVirB12標(biāo)記株毒力稍弱于A19株。

圖5 A19－ΔVirB12BALB／c鼠體內(nèi)傳代的PCR鑒定Fig.5 Identification of A19－ΔVirB12 in vivo with BALB／c mice by PCR M：DL2000DNA marker；1：The first generation of A19－ΔVirB12strain；2：The second generation of A19－ΔVirB12strain；3：The third generation of A19－ΔVirB12strain；4：The fourth generation of A19－ΔVirB12strain；5：The fifth generation of A19－ΔVirB12strain；6：Negative control；7：A19

2.7 免疫保護(hù)力測(cè)定 將A19和 A19－ΔVirB12菌株培養(yǎng)增殖計(jì)數(shù)，以5.0×104CFU／只劑量免疫BALB／c鼠，在第45d分別對(duì)每組BALB／c鼠攻毒強(qiáng)毒菌株2308，攻毒后15d剖殺并無(wú)菌采集脾臟勻漿進(jìn)行攻毒菌株分離。通過(guò)比較免疫接種組和對(duì)照組小鼠每克脾臟中攻毒菌株2308的載菌量（克脾指數(shù)），評(píng)價(jià)各菌株的免疫保護(hù)效果，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，與PBS對(duì)照組相比，A19和 A19－ΔVirB12均對(duì)BALB／c鼠有一定程度的免疫保護(hù)，且A19和A19－ΔVirB12之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），A19－ΔVirB12株并沒(méi)有因?yàn)槿笔?VirB12基因而使其免疫保護(hù)力下降。

3 討 論

我國(guó)應(yīng)用牛布魯氏菌A19疫苗株在防治牛布魯氏菌病方面取得明顯的效果，但常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)與診斷方法不能將其與自然感染相區(qū)分，這對(duì)我國(guó)布魯氏菌病防治與凈化是不利的。解決該難題的方法之一是尋找具有抗原性的蛋白抗原，然后敲除相應(yīng)的基因，建立相應(yīng)的檢測(cè)方法。本研究以牛流產(chǎn)布魯氏菌A19弱毒疫苗株為親本株，通過(guò)同源重組技術(shù)將四型分泌系統(tǒng)中VirB12基因敲除，PCR證實(shí)了構(gòu)建的標(biāo)記疫苗株VirB12基因被敲除，獲得了具有診斷標(biāo)記抗原的A19－ΔVirB12突變株。

表1 A19株和A19－ΔVirB12株毒力測(cè)定Tab.1 Determination on virulence of A19and A19－ΔVirB12strains

表2 A19和A19－ΔVirB12對(duì)BALB／c鼠免疫保護(hù)力Tab.2 Protection of immunized mice against 2308strainchallenging

布魯氏菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS）由一個(gè)含有12個(gè)可跨越細(xì)菌被膜的多蛋白復(fù)合物家族組成，并由同一啟動(dòng)子調(diào)控，是繼脂多糖之后又一個(gè)關(guān)鍵的致病力因子[12]。VirB1～12是細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和形成持續(xù)感染所必須的，與其在宿主細(xì)胞內(nèi)生存、復(fù)制有關(guān)[13－16]。其中 VirB12基因由519bp組成，編碼173個(gè)氨基酸，VirB12蛋白分子量約17kDa。相關(guān)研究證實(shí)VirB12在牛種布魯氏菌感染中是一種免疫原性蛋白，在小鼠感染布魯氏菌的過(guò)程中均有表達(dá)，但在T4SS中并不是必需蛋白，它可作為一種布魯氏菌血清學(xué)檢測(cè)標(biāo)記抗原[17]。因此，本研究中將成功構(gòu)建的缺失VirB12基因的A19－ΔVirB12突變株為研究對(duì)象，對(duì)該突變株毒力和免疫保護(hù)力進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)VirB12基因的缺失對(duì)該菌株毒力有所減弱，但對(duì)其免疫保護(hù)力基本無(wú)影響。同時(shí)，以VirB12蛋白作為標(biāo)記診斷抗原可建立布魯氏菌血清學(xué)檢測(cè)方法，這為鑒別區(qū)分A19－ΔVirB12疫苗免疫與自然感染的血清學(xué)方法奠定了基礎(chǔ)。

與布魯氏菌傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)鑒定方法相對(duì)比，PCR檢測(cè)方法具有快速、特異，并能降低實(shí)驗(yàn)室操作者的感染風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)鑒別區(qū)分布魯氏菌牛流產(chǎn)野毒株和疫苗株有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[18]。本研究以VirB12基因作為鑒別診斷標(biāo)記，建立了區(qū)分鑒定布病A19－ΔVirB12疫苗株與野毒流行菌株的PCR鑒定方法，該診斷方法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)布魯氏菌鑒定方法的不足，為布病的流行病學(xué)調(diào)查及防控措施的制定提供科學(xué)的技術(shù)支撐。

綜上所述，對(duì)A19－ΔVirB12突變株的基本特性、小鼠毒力和免疫保護(hù)效力測(cè)定，初步確定該菌株遺傳背景清晰、遺傳性狀穩(wěn)定，具備布魯氏菌病新型標(biāo)記疫苗的基本特性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示，布魯氏菌分子標(biāo)記A19－ΔVirB12疫苗株毒力弱于親本株A19，但其免疫保護(hù)力在BALB／c鼠體內(nèi)與親本菌株A19無(wú)顯著差異，有望開(kāi)發(fā)成為布魯氏菌病標(biāo)記疫苗。以敲除的VirB12基因?yàn)樵\斷標(biāo)記，可建立區(qū)分布病A19－ΔVirB12疫苗株與流行菌株的病原學(xué)PCR鑒定方法。以VirB12基因編碼表達(dá)的VirB12蛋白作為標(biāo)記抗原，可建立鑒別區(qū)分A19－ΔVirB12疫苗免疫與自然感染動(dòng)物的血清學(xué)方法，明顯提升了原有A19疫苗的功能，但究竟A19－ΔVirB12突變株在靶動(dòng)物體內(nèi)的免疫效力如何還需進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

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