倪 斌，張義全，黃新祥，楊瑞馥，周冬生

2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071；Email：nibinyl＠gmail.com

鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌（以下簡(jiǎn)稱鼠疫菌）引起的一種人獸共患病，人類通常被帶菌蚤體叮咬而被感染，臨床表現(xiàn)主要有腺鼠疫、肺鼠疫和敗血癥鼠疫[1]。鼠疫菌在感染早期被巨噬細(xì)胞吞噬，并能在其中生存繁殖[2]，這表明鼠疫菌能通過一系列的自我調(diào)節(jié)，從而抵抗巨噬細(xì)胞內(nèi)一系列殺菌物質(zhì)（特別是活性過氧化物）的殺菌作用。其中，由轉(zhuǎn)錄調(diào)控子對(duì)特定靶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)，起著關(guān)鍵的作用。

OxyR蛋白是LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子之一，在細(xì)菌抗氧化過程中發(fā)揮重要作用，其分子內(nèi)的兩個(gè)對(duì)過氧化物敏感的半胱氨酸殘基（Cys－199和Cys－208）能被氧化成二硫鍵，并促進(jìn)其寡聚化（二聚體或四聚體）而具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性[3]。研究表明，大腸桿菌OxyR的調(diào)控元基因大多與細(xì)菌抗氧化有關(guān)，比如dps、gorA、grxA、katG、fur、ahpCF等[4－5]；另外，OxyR還能激活小RNA基因oxyS的轉(zhuǎn)錄，因而OxyR又能通過OxyS調(diào)節(jié)其它基因的表達(dá)[4]。鼠疫菌OxyR蛋白也參與抗氧化調(diào)節(jié)，特別是能直接激活katY的表達(dá)[6]。鼠疫菌KatY蛋白首次發(fā)現(xiàn)于1956年，它是一種溫度依賴型蛋白，在37。C時(shí)高表 達(dá)[6－7]。KatY分子具有4種亞型，即α－KatY（～70kDa）、β－KatY（～50kDa）、γ－KatY（～36kDa）和δ－KatY（～34kDa），小分子量的γ－和δ－亞型可能是α－或β－亞型的酶解產(chǎn)物[6－7]。α－與α－KatY 或α－與β－KatY能形成4聚體而具有過氧化物酶及觸酶活性，進(jìn)而解除過氧化物（比如H2O2）對(duì)細(xì)胞的毒害，有利于鼠疫菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存[6－7]。

雖然已經(jīng)證明鼠疫菌OxyR能直接激活katY的表達(dá)[6]，但是katY的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及OxyR與katY啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用機(jī)制并未被闡明。本文利用引物延伸實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)定量RT－PCR實(shí)驗(yàn)、凝膠阻滯（EMSA）實(shí)驗(yàn)以及DNase I足跡實(shí)驗(yàn)等經(jīng)典的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，進(jìn)一步完善了OxyR對(duì)katY的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 His－OxyR蛋白表達(dá)菌、鼠疫菌201株（野生型，WT）及其oxyR突變株（ΔoxyR）等均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 實(shí)驗(yàn)所用的Primer Extension System、fmol?DNA Cycle Sequencing System等為Promega產(chǎn)品；TRIzol Reagent為Invitrogen產(chǎn)品；TaqDNA連接酶、dNTPs為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化試劑盒為QIAGEN產(chǎn)品。

1.2 鼠疫菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 取50μL甘油菌種接種于18mL的TMH[8]培養(yǎng)基中（50mL的三角燒瓶，加玻璃珠，下同），26。C下230r／min培養(yǎng)至平臺(tái)期，按1∶20稀釋接種至新鮮的TMH培養(yǎng)基中，26。C下230r／min培養(yǎng)至OD620≈1.0，再按1∶20稀釋接種至新鮮的TMH培養(yǎng)基中，26。C下230r／min連續(xù)培養(yǎng)，并每隔3h取一次樣，測(cè)其OD620的吸光度值，最后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D620的值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3 凝膠阻滯（EMSA）實(shí)驗(yàn)[9]PCR 擴(kuò)增katY（引物序列見表1）的啟動(dòng)子區(qū)序列并對(duì)產(chǎn)物純化回收。用T4多聚核苷酸激酶（T4PNK）和[γ－32P]ATP（5 000Ci／mmol，10mCi／mL）對(duì)DNA片段5′末端進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記的DNA和不同濃度的His－OxyR蛋白在特定的反應(yīng)體系中，室溫共同孵育20 min后，進(jìn)行4%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影后分析結(jié)果。

表1 本研究所用引物Tab.1 Oligonucleotide primers used in this study

1.4 DNase I足跡實(shí)驗(yàn)[9]利用[γ－32P]ATP對(duì)特異性引物（引物序列見表1）的5′末端進(jìn)行標(biāo)記，以鼠疫菌201株基因組DNA為模板，用被標(biāo)記的引物和對(duì)應(yīng)未標(biāo)記的配對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物可作為足跡實(shí)驗(yàn)的探針。探針和不同量的His－OxyR蛋白在特定的結(jié)合體系中室溫共同孵育30min，再用合適濃度的DNaseⅠ消化適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（30～60s），消化產(chǎn)物配伍測(cè)序條帶進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影分析結(jié)果。

1.5 引物延伸實(shí)驗(yàn)[10]將與katY的mRNA互補(bǔ)的特異性引物（表1）5′－末端用[γ－32P]ATP進(jìn)行放射性標(biāo)記，并將其退火到mRNA上（分別以等量的WT和ΔoxyR的總RNA為模板），進(jìn)而將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配伍測(cè)序條帶進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影后，通過引物延伸條帶的位置即可確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，而根據(jù)其相對(duì)豐度即可判定OxyR對(duì)katY的調(diào)控關(guān)系。

1.6 實(shí)時(shí)定量 RT－PCR[10]提取 WT 和ΔoxyR的總RNA，并用 DNA－freeTMKit（Amibion）消化去除其中的DNA污染，再用N6隨機(jī)引物將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用Roche的LightCycler system作實(shí)時(shí)定量RT－PCR。將cDNA進(jìn)行系列稀釋，并以16SrRNA的cDNA為內(nèi)參繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于katY表達(dá)水平的相對(duì)定量。

2 結(jié) 果

2.1 鼠疫菌在TMH中的生長(zhǎng)狀態(tài) 從圖1可以看出：在TMH中，ΔoxyR的生長(zhǎng)速率比 WT的稍慢，但從對(duì)數(shù)末期開始二者基本趨于一致，在24h時(shí)達(dá)到平臺(tái)期，且其OD值均能達(dá)到2.0以上，這說明oxyR的缺失對(duì)鼠疫菌在TMH中的生長(zhǎng)沒有太大的影響。根據(jù)生長(zhǎng)曲線，我們向OD620≈1.0的培養(yǎng)物中加入終濃度為10mmol／L過氧化氫，并繼續(xù)培養(yǎng)30min后收集菌體，供后續(xù)的分子生化實(shí)驗(yàn)用。

圖1 WT和ΔoxyR在TMH中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Yersinia pestis growth curves Cell cultured with an OD620value of about 1.0in TMH medium were diluted 1∶20into 18mL of the corresponding fresh medium.Bacteria were then grown at 26。C with shaking at 230r／min，and the OD620values were monitored for each culture with a 3hinterval until the cultures reached the stationary phase.

2.2 OxyR能結(jié)合到katY的啟動(dòng)子區(qū) 在本室前期的研究中，已證明OxyR能結(jié)合到katY的啟動(dòng)子區(qū)[6]。本文中，首先利用EMSA實(shí)驗(yàn)，重復(fù)驗(yàn)證了OxyR蛋白對(duì)katY啟動(dòng)子區(qū)具有結(jié)合作用，結(jié)果如圖2A）所示：隨著 His－OxyR蛋白濃度的不斷增加，自由DNA條帶越來越弱（泳道1到4），當(dāng)先向反應(yīng)體系中加入未標(biāo)記的katY啟動(dòng)子區(qū)DNA（Cold probe，第5泳道）后，由于蛋白先與Cold probe結(jié)合就不能再結(jié)合探針，這樣自由條帶就會(huì)增加，阻滯帶就會(huì)消失或減少，而加入16SrDNA作為negative probe（第6泳道）就沒有這種效應(yīng)；而當(dāng)只加入鼠疫菌F1抗原蛋白（Un－related protein，第7泳道）時(shí)，由于F1抗原蛋白是非調(diào)控子蛋白，它不能與katY啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，而不出現(xiàn)阻滯條帶。上述結(jié)果表明His－OxyR蛋白對(duì)katY啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合是特異性的。

圖2 EMSA實(shí)驗(yàn)（A）和DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)（B）放射自顯影結(jié)果Fig.2 EMSA and DNase I footprinting assays of binding of His－OxyR to katYpromoter region

進(jìn)一步利用DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)來確定OxyR對(duì)katY啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位置，結(jié)果如圖2B）所示：“1 2 3 4 5”為蛋白量從低到高的不同蛋白梯度，“1”為未加蛋白的參照，coding是指被標(biāo)記引物是上游引物，Non－coding指被標(biāo)記引物是下游引物。根據(jù)“G A T C”測(cè)序條帶，我們可以得出OxyR對(duì)katY啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位置為－101至－48之間的堿基（翻譯起始位點(diǎn)為“＋1”），這比前期所得的結(jié)合序列長(zhǎng)了許多[6]，但是其核心區(qū)域是一致的，其主要原因可能是探針制備方法不同所致。

2.3 OxyR激活katY的轉(zhuǎn)錄 我們利用引物延伸和RT－PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究OxyR對(duì)katY的調(diào)控關(guān)系。圖3A為引物延伸結(jié)果：若以翻譯起始位點(diǎn)為＋1，katY的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為－26位的堿基G，且我們只在WT中檢測(cè)出了引物延伸條帶，而在ΔoxyR中沒檢測(cè)出，這表明鼠疫菌OxyR能促進(jìn)katY的轉(zhuǎn)錄；圖3B為RT－PCR結(jié)果，可以看出：WT中katY的mRNA豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ΔoxyR中的，二者具有4倍以上的差異，這進(jìn)一步表明OxyR能促進(jìn)katY的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

2.4 鼠疫菌katY啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu) 圖4為katY基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)示意圖：包含翻譯起始位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) P、OxyR 結(jié)合位點(diǎn)、－10和－35區(qū)以及Shine－Dalgarno序列（SD序列，為核糖體識(shí)別位點(diǎn)）。

圖3 OxyR對(duì)katY調(diào)控的引物延伸（A）和RT－PCR實(shí)驗(yàn)（B）結(jié)果Fig.3 OxyR activation of the transciption of katY

圖4 鼠疫菌katY啟動(dòng)子區(qū)示意圖Fig.4 Organization of katYpromoter DNA region Shown were translation and transcription starts，Shine－Dalgarno box，predicted OxyR sites，and－10and－35core promoter elements.

3 討 論

之前的研究表明：當(dāng)鼠疫菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，katY即迅速表達(dá)，這與OxyR能直接激活katY的轉(zhuǎn)錄有關(guān)[6]。但是前期的研究并沒有詳細(xì)闡述OxyR對(duì)katY調(diào)控機(jī)制。本文中，我們利用引物延伸實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)定量RT－PCR、EMSA、DNase I足跡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，完善了OxyR對(duì)katY基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。圖4為katY啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)：P為katY的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，－10和－35區(qū)為RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)，Shine－Dalgarno序列為核糖體結(jié)合位置?？梢钥闯鯫xyR的結(jié)合位點(diǎn)覆蓋－35區(qū)，而不覆蓋－10區(qū)，這表明OxyR對(duì)katY的激活可能是通過與RNA聚合酶σ亞基的C－末端結(jié)構(gòu)域（σCTD）相互作用，從而有利于σ亞基對(duì)－10和－35區(qū)的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。簡(jiǎn)而言之，OxyR對(duì)katY基因的激活，是通過OxyR、RNA聚合酶及katY啟動(dòng)子區(qū)DNA序列的共同相互作用而實(shí)現(xiàn)的。

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