王雪敏，姚建楠，，李蓓蓓，楊傳定，邵東華，王少輝，馬志永

甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin－resistantStaphylococcusaureus，MRSA）目前已經(jīng)成為醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的主要病原菌之一，它可以引起人的心內(nèi)膜炎、肺炎、菌血癥等致死性感染[1]。近年來，MRSA的臨床分離率呈明顯上升趨勢，并且對(duì)臨床使用的多種常用抗菌藥物表現(xiàn)出交叉耐藥和多重耐藥的特點(diǎn)，這給臨床治療帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。MRSA的耐藥機(jī)制主要是獲得了外源性甲氧西林決定子基因（methicillin－resistant determinant A，mecA），該基因編碼青霉素結(jié)合蛋白2α，造成對(duì)所有β－內(nèi)酰胺類藥物耐藥。而SCCmec是一種可移動(dòng)的遺傳元件，該元件還攜帶除mecA基因外的其他抗生素耐藥基因，造成多重耐藥。SCCmecⅠ，Ⅱ，Ⅲ型主要存在于醫(yī)院獲得性MRSA（Hospitalacquired／associated MRSA，HA－MRSA）中，該菌種中mecA復(fù)合體的下游帶有多個(gè)質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座子。SCCmecIV型和SCCmecV型通常存在于社區(qū)獲得性 MRSA（Community－acquired／associated MRSA，CA－MRSA）和非多重耐藥 MRSA菌株中，其分子較小，除mecA外幾乎不攜帶其他多重耐藥基因，易移動(dòng)并通過質(zhì)?；蚴删w傳播至不同遺傳背景的葡萄球菌中，容易在人群中傳播和定植。殺白細(xì)胞素（Panton－Valetine Leukocidin，PVL）是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種可以導(dǎo)致壞死性感染的細(xì)胞外毒素，嚴(yán)重時(shí)可以引起人的壞死性肺炎等[2]。近年來，MRSA流行病學(xué)發(fā)生很大變化，出現(xiàn)了另一類導(dǎo)致人類嚴(yán)重感染的牲畜相關(guān)性 MRSA（Livestock－associated MRSA，LA－MRSA），已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道LA－MRSA能夠在豬和人之間傳播[3－5]，所以豬源MRSA引起了全世界的廣泛關(guān)注。本研究通過調(diào)查上海地區(qū)豬源MRSA的流行狀況、耐藥譜特征及其SCCmec基因分型特點(diǎn)，闡明上海地區(qū)豬源MRSA的流行情況及其主要的流行型，以期指導(dǎo)豬場合理用藥，同時(shí)為動(dòng)物源MRSA向人傳播的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品及標(biāo)準(zhǔn)菌株來源 于2011年8月—2012年5月分別在上海市5個(gè)規(guī)?；i場和1個(gè)屠宰場，采集豬鼻腔拭子樣品共計(jì)232份。質(zhì)控菌株ATCC 29213來源于本實(shí)驗(yàn)保存。

1.2 主要試劑及抗生素來源 MH肉湯，腦心浸液培養(yǎng)基 （BHI），7.5% 氯 化 鈉 肉 湯 （7.5%Sodium Chloride Broth）均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基購自上海市科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司；抗生素阿奇霉素（AZI）、紅霉素（ERY）、氯霉素（CHL）、氟苯尼考（FLO）和諾氟沙星（NOR）購自山西恒豐強(qiáng)動(dòng)物藥業(yè)有限公司；慶大霉素（GEN）購自濮陽泓天威藥業(yè)有限公司；頭孢噻呋（CEF），萬古霉素（VAN）購自浙江海正有限公司；利奈唑胺（LNZ），瑞他怕林（REP）購自上海景顏化工科技有限公司；苯唑西林（OXA），沃尼妙林（VAL），泰妙菌素（TIA），阿米卡星（AMK）購自浙江康恩貝股份有限公司；2×Taq PCR MasterMix，2 000bp DNA Ladder Marker及細(xì)菌基因組提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司（北京）。

1.3 引物 本研究使用引物（見表1）均由英俊生物技術(shù)有限公司（上海）合成。

1.4 DNA的提取 根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根）說明書提取，－20。C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5SA和MRSA的分離鑒定 將采集的豬鼻腔拭子浸出液先接種于7.5%氯化鈉肉湯中，37。C，200 r／min搖床培養(yǎng)12～16h，然后劃線于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)24h，再挑取疑似菌落接種于BHI培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)12～16h。nuc基因和mecA基因進(jìn)行雙重PCR鑒定SA或MRSA。

1.6 MRSA 的耐藥性檢測 參照 CLSI[7]標(biāo)準(zhǔn)用肉湯稀釋法測定藥物最小抑制濃度（MIC）。

1.7 SCCmec基因分型 SCCmec基因分型采用多重PCR，引物及反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[7]。

1.8PVL基因檢測 采用20μL反應(yīng)體系，體系參數(shù)為：2×Taq PCR MasterMix（天根）10μL，DNA模板0.5μL，PVL基因上下游引物[8]各0.5 μL，去離子水8.5μL。PCR循環(huán)參數(shù)為95。C預(yù)變性4min，94。C40s、55。C30s、72。C1min，共31個(gè)循環(huán)，72。C終延伸7min，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 SA和MRSA的分離鑒定 232個(gè)樣品通過7.5%氯化鈉肉湯預(yù)增菌，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基顯色培養(yǎng)及雙重PCR方法分離得到139株SA，其中70株MRSA，占總樣品數(shù)的30.2%（70／232），與已報(bào)道的國內(nèi)豬群中MRSA檢出率比較，高于河北地區(qū)（25.0%），明顯高于湖北地區(qū)（12.1%），陜西地區(qū)（8.5%），四川地區(qū)（1.6%）等[9]。值得注意的是本研究各個(gè)豬場間MRSA檢出率不盡相同，尤其以浦東地區(qū)的檢出率最低（表2）。存在這種差異性的原因可能與各個(gè)豬場豬的來源、抗生素的使用、喂養(yǎng)的方式、環(huán)境因素等有關(guān)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

表2 上海地區(qū)SA及MRSA檢測結(jié)果Tab.2 Isolation results of SA and MRSA in Shanghai areas

2.2 MRSA抗菌藥物耐藥性及SCCmec基因分型

豬源MRSA對(duì)14種常用抗生素的耐藥性，表現(xiàn)出交叉耐藥和多重耐藥的特點(diǎn)。除對(duì)LNZ、VAN和AMK全部敏感外，對(duì)CEF、GEN和NOR耐藥率分別為74.3%，62.9%和42.9%；對(duì) AZI、ERY、CHL、FLO和OXA耐藥率100%，對(duì)重要人醫(yī)用藥REP和重要畜禽專用藥VAL和TIA也全部耐藥。MRSA對(duì)14種抗生素的耐藥數(shù)據(jù)見表3。MRSA的多重耐藥一直是臨床治療面臨的難題，伴隨著近年來MRSA分離率增加，這一問題顯得尤為突出。從本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以看出，豬源MRSA的耐藥率很高，除了對(duì)LNZ、VAN和AMK敏感外，其余11種都有耐藥，且多表現(xiàn)為多重耐藥。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)所有MRSA菌株對(duì)截短側(cè)耳類藥物REP，VAL和TIA表現(xiàn)出高水平耐藥。截短側(cè)耳類藥物是在天然化合物截短側(cè)耳素（pleuromutilin）的基礎(chǔ)上進(jìn)行化學(xué)修飾改造獲得的一類抗菌藥物。該類藥物的代表泰妙菌素和沃尼妙林是畜禽專用藥，用于獸醫(yī)臨床上多種細(xì)菌感染的治療。近年來興起了開發(fā)新的截短側(cè)耳類衍生物用于治療人類細(xì)菌感染。Retapamulin是第一個(gè)用于人醫(yī)的截短側(cè)耳類藥物，2007年被批準(zhǔn)用于由金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌引起的皮膚感染和傷口感染。研究表明，REP耐藥株在人源金黃色葡萄球菌中檢出率非常低（5 676株中僅6株表現(xiàn)敏感性降低或者耐藥[10]），這也說明該類藥物在人醫(yī)上的開發(fā)潛力巨大。與人源相比，動(dòng)物源金黃色葡菌對(duì)截短側(cè)耳類藥物的耐藥情況則非常嚴(yán)重。在對(duì)瑞士2009—2010年間分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的研究中發(fā)現(xiàn)，90%的菌株對(duì)泰妙菌素耐藥[11]。在德國GERM－Vet項(xiàng)目中分離到的68株MRSA中有9株檢測到對(duì)截短側(cè)耳類藥物的耐藥。這些菌株不僅來源于豬，而且還分離自牛、火雞以及零售肉制品[12]。本實(shí)驗(yàn)所有豬源 MRSA菌株對(duì)3種截短側(cè)耳類藥物全部表現(xiàn)高水平耐藥，應(yīng)引起我們足夠重視，這也提示我們要防控動(dòng)物源耐藥菌／耐藥基因通過食物鏈或者環(huán)境向人類的傳播，否則一些類似于REP的新型抗菌藥物在人醫(yī)上的應(yīng)用前景將大打折扣。

本研究是首次對(duì)上海地區(qū)豬源MRSA耐藥基因進(jìn)行分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有豬源MRSA SCCmec分型均為Ⅳb型，與王新等報(bào)道的陜西地區(qū)豬源MRSA SCCmec基因型一致，與崔生輝等[9]報(bào)道的四川地區(qū)（SCCmecⅢ型），河北地區(qū)（SCCmecⅢ型），湖北地區(qū)（SCCmecⅢ型）豬源MRSA分型不一致。本次試驗(yàn)并未檢測到PVL毒力基因。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道我國人源醫(yī)院相關(guān)性 MRSA（Hospital－acquired／associated MRSA，HA－MRSA）主要流行SCCmecⅢ型，并且具有交叉耐藥和多重耐藥的特點(diǎn)[13－14]。另一類社區(qū)相關(guān)性 MRSA（Community－acquired／associated MRSA，CA－MRSA）則主要流行 SCCmecⅣ和SCCmecⅤ型，但為非多重耐藥性菌株[14]。本研究結(jié)果顯示SCCmecⅣb型的豬源MRSA的耐藥性嚴(yán)重，不同于SCCmecⅣ型的非多重耐藥性CA－MRSA，推測豬源MRSA可能存在其他耐藥機(jī)制，還有待進(jìn)一步的研究證明。這也警示我們應(yīng)該謹(jǐn)防豬源MRSA通過食物鏈或環(huán)境向社區(qū)傳播，否則一些非多重耐藥性CA－MRSA成為耐藥性菌株，對(duì)公共衛(wèi)生和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

表3 MRSA對(duì)14種抗生素的耐藥數(shù)據(jù)Tab.3 Antimicrobial susceptibility data of MRSA to 14antibiotics

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