葉金艷，祝建軍，李英龍，李永祥，杜玉海，李桂軍，高雯潔，顧蓓青，吳曉燕，宋秀蘭

志賀菌（shigella）至今仍是影響人類腸道健康的主要致病菌之一，引起人類細(xì)菌性痢疾［1］。嬰幼兒胃腸道抵抗力弱，對(duì)志賀菌更加具有易感性。近年來(lái)在抗菌素的壓力下志賀菌出現(xiàn)多重耐藥，使臨床用藥顯得棘手，而兒科適用藥物譜較狹窄，治療更為困難。有關(guān)志賀菌耐藥機(jī)制的探討，我們?cè)鴮?duì)復(fù)方新諾明耐藥相關(guān)基因、氯霉素類基因、β－內(nèi)酰胺類基因做了研究［2－4］，由于試驗(yàn)菌株少，不能反應(yīng)嘉興地區(qū)志賀菌的耐藥狀況。因此，為進(jìn)一步了解志賀菌對(duì)常用藥的耐藥機(jī)制，本研究共篩選了嘉興地區(qū)耐藥志賀菌58株，檢測(cè)了β－內(nèi)酰胺類基因、復(fù)方新諾明耐藥相關(guān)基因、接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座酶、插入序列和整合子，共14種耐藥相關(guān)基因，用指標(biāo)聚類分析（SPSS法）分析獲得性耐藥相關(guān)基因和可移動(dòng)元件遺傳標(biāo)記存在狀況的相關(guān)性。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株 58株多重耐藥志賀菌分離自嘉興地區(qū)7家醫(yī)院2006年11月—2012年10月間住院及門診患者的大便標(biāo)本。菌株使用ATB－EXPRESSION細(xì)菌鑒定儀及志賀菌診斷血清鑒定到種。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922；肺炎克雷伯菌700603（ESBLs陽(yáng)性質(zhì)控菌）。

1．2 方法

1．2．1 抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 采用K－B紙片擴(kuò)散法，根據(jù)美國(guó)抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）2010年版要求測(cè)定12種抗菌藥物的敏感性，藥敏紙片均為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品。超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）表型確證試驗(yàn)參照CLSI 2010年版大腸埃希菌及克雷伯菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)。頭孢哌酮／舒巴坦的判定標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI 2010年版頭孢哌酮的折點(diǎn)。

1．2．2 細(xì)菌處理 挑純培養(yǎng)菌落置入0．5mL離心管內(nèi)（內(nèi)預(yù)置200ng／mL蛋白酶 K溶液200 μL），56℃水浴2h，改95℃水浴10min，離心（15 000r／min）30s。上清液即為基因檢測(cè)的模板液，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 基因檢測(cè) traA、trbC、tnp513、int I 1、ISEcp1、IS26、IS903、TEM、SHV、CTXM－1、OXA、qacEΔlsul1、dfrA1、dfrA12檢測(cè)均為PCR法。蛋白酶K消化法制備DNA擴(kuò)增模板。靶基因引物識(shí)別序列和目的產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。各種靶基因PCR擴(kuò)增體系均為：每反應(yīng)體系P1引物1μL（1．0μmol／L）、P2引物1μL （1．0μmol／L），dNTPs 2μL （2 mmol／L），10 倍 緩 沖 液 2μL ［KCl 10mmol／L，（NH4）2SO48mmol／L，MgC122mmol／L，Tris－HC1（pH9．0）10mmol／L，NP40 0．5%，BSA 0．02%］，Taq DNA pol 1u（不計(jì)體積），超純水9 μL，模板液5μL，總反應(yīng)體積20μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物＞500bp，熱循環(huán)參數(shù)均為：93℃預(yù)變性2min，然后93℃60s，55℃60s，72℃60s，循環(huán)35個(gè)周期，最后一個(gè)72℃延長(zhǎng)至5min，其余均為：93℃預(yù)變性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循環(huán)35個(gè)周期，最后一個(gè)72℃延長(zhǎng)至5min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照分子相當(dāng)?shù)哪康臈l帶為陽(yáng)性。檢測(cè)試劑盒、靶基因PCR引物序列及陽(yáng)性對(duì)照DNA由無(wú)錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。

1．2．4 陽(yáng)性基因測(cè)序 選擇部分菌株用和CTXM－1群相同的引物進(jìn)行測(cè)序。PCR陽(yáng)性產(chǎn)物為PCR直接全自動(dòng)熒光法測(cè)序，委托上海博尚生物技術(shù)有限公司完成（測(cè)序在美國(guó)ABI公司3730型毛細(xì)管全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行）。

1．2．5 序列對(duì)比 讀序工具軟件為Chromas，測(cè)序結(jié)果用Chromas直接與美國(guó)核酸庫(kù)（GenBank）作BLASTn（www．ncbi．nlm．nih．gov／BLASTn）比對(duì)。

1．2．6 聚類分析 進(jìn)行β內(nèi)酰胺類、復(fù)方新諾明耐藥相關(guān)基因與接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座酶、插入序列、整合子基因檢測(cè)結(jié)果的指標(biāo)聚類分析（SPSS 18．0）。

表1 靶基因名稱和PCR引物序列Tab．1 Target genes and the primer sequence of PCR

2 結(jié) 果

2．1 58株志賀菌對(duì)12種抗生素耐藥率 58株志賀菌ESBLs均為陽(yáng)性，其對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明耐藥率較高，分別為100．0%、89．7%、89．7%、89．7%；耐藥率為0的為亞胺培南、頭孢哌酮／舒巴坦、阿米卡星；氨芐西林／舒巴坦、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、氯霉素和慶大霉素耐藥率在30%～70%。

2．2 耐藥相關(guān)基因檢測(cè) 對(duì)58株志賀菌進(jìn)行耐藥相關(guān)基因的檢測(cè)，陽(yáng)性率超過(guò)了55．0%的可移動(dòng)元件為3種，分別為插入序列遺傳標(biāo)記基因ISEcp1 75．9%（44／58）、整合子遺傳標(biāo)記基因intI 1 60．3%（35／58）、接合性質(zhì)粒遺傳標(biāo)記基因traA 55．2%（32／58）。陽(yáng)性率見(jiàn)表2。檢測(cè)均陰性的基因?yàn)镾HV型β－內(nèi)酰胺類基因、插入序列IS26、轉(zhuǎn)座酶tnp513，未列在表內(nèi)。

2．3 測(cè)序 選擇11株菌株用和CTX－M－1群相同的引物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得序列經(jīng)比對(duì)與美國(guó)核酸庫(kù)（GenBank）已登錄的 CTM－M－55序列均100%相同。CTM－M－55基因測(cè)序圖見(jiàn)圖1。

2．4 指標(biāo)聚類分析 檢測(cè)結(jié)果的指標(biāo)聚類分析見(jiàn)圖2。

表2 志賀菌基因檢測(cè)陽(yáng)性率（%）Tab．2 Positive rate of Shigellagene testing（%）

圖1 志賀菌屬CTX M－55基因測(cè)序圖Fig．1 CTX M－55gene sequence of Shigellaisolates

3 討 論

圖2 檢測(cè)結(jié)果的指標(biāo)聚類分析Fig．2 Index cluster analysis of the test results

細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥機(jī)制可分突變耐藥和獲得性耐藥。獲得性耐藥是指細(xì)菌通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移，從其它細(xì)菌獲得外源性耐藥基因，整合在自身基因組上?？梢苿?dòng)遺傳元件，不僅可以通過(guò)耐藥基因的載體傳遞導(dǎo)致獲得性耐藥基因，并可使耐藥基因高表達(dá)，它們還與細(xì)菌耐藥程度相關(guān)?；蛩睫D(zhuǎn)移就是由介導(dǎo)各種耐藥基因的可移動(dòng)遺傳元件（質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、噬菌體、插入序列共同區(qū)等）完成，它們可以在同種細(xì)菌甚至不同種細(xì)菌菌株間傳遞［5］，從而使細(xì)菌的耐藥性得以快速傳播。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有較多關(guān)于質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)遺傳元件致各類細(xì)菌獲得性耐藥［6－10］的報(bào)告。本組資料中我們?cè)?種可移動(dòng)遺傳元件檢出5種陽(yáng)性基因，陽(yáng)性率超過(guò)了55．0%的可移動(dòng)元件為3種，分別為插入序列遺傳標(biāo)記基因ISEcp1 75．9%（44／58）、整合子遺傳標(biāo)記基因intI 1 60．3%（35／58）、接合性質(zhì)粒遺傳標(biāo)記基因traA 55．2%（32／58）。對(duì)于志賀菌方面的研究，苑廣盈等［11］證實(shí)志賀菌可通過(guò)質(zhì)粒水平傳遞ESBLs而導(dǎo)致耐藥。王淑玲等［12］驗(yàn)證志賀菌通過(guò)耐多藥相關(guān)基因（T1C4）進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致對(duì)多種藥物的抗性。從而顯示可移動(dòng)元件在參與志賀菌多重耐藥基因轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用不容忽視。

intⅠ1為Ⅰ類整合子的遺傳標(biāo)記，Ⅰ類整合子的3′端包括qacEΔ1－sul1，qacEΔ1－sul1也可作為Ⅰ類整合子的遺傳標(biāo)記，且可以被轉(zhuǎn)座。本組資料檢測(cè)出intI 1 60．3%，qacEΔl－sul1 13．8%，陽(yáng)性率相差較大的原因可能因?yàn)橐徊糠终厦富騣ntⅠ1或3′端 的qacEΔ1－sul1可從Ⅰ類整合子中被轉(zhuǎn)座，因此造成兩者的比例不相符。本組資料復(fù)方新諾明耐藥相關(guān)基因dfrA1 96．6%（56／58），復(fù)方新諾明的耐藥率高為89．7%，與攜帶復(fù)方新諾明耐藥相關(guān)基因密切相關(guān)。

轉(zhuǎn)座子是能將自身基因插入基因組中任何一個(gè)序列上的一組DNA序列。轉(zhuǎn)座子從一個(gè)位置轉(zhuǎn)座到另一個(gè)位置轉(zhuǎn)入和切出的過(guò)程，改變了原有基因的結(jié)構(gòu)和排序，從而產(chǎn)生了突變。并且當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到某個(gè)功能基因內(nèi)部或鄰近位點(diǎn)時(shí)，就會(huì)使插入位置的基因失活并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型。插入序列則是最簡(jiǎn)單的一類轉(zhuǎn)座子，由一段編碼轉(zhuǎn)座酶的DNA序列構(gòu)成。一個(gè)耐藥轉(zhuǎn)座子可表現(xiàn)為對(duì)某種抗生素耐藥，而插入序列沒(méi)有這種功能，只編碼轉(zhuǎn)座酶。本組資料轉(zhuǎn)座子中檢出插入序列ISEcp1、IS903分別為75．9%（44／58）、13．8（8／58）。

可移動(dòng)遺傳元件中的接合性質(zhì)粒有泛宿主和狹宿主之分。狹宿主轉(zhuǎn)移限制在少量相似種屬的細(xì)菌之間，而泛宿主則能夠在不同種屬的細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移元件。traA和trbC分別是狹宿主性和泛宿主性接合性質(zhì)粒遺傳標(biāo)記。一些泛宿主在革蘭陰性菌內(nèi)沒(méi)有宿主限制，并能把質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到革蘭陽(yáng)性菌和真菌等單細(xì)胞真核生物，為耐藥基因的廣泛傳播提供了良好的載體。張嶸等［13］在志賀菌中通過(guò)接合試驗(yàn)，20株產(chǎn)ESBL志賀菌中18株質(zhì)粒接合試驗(yàn)成功，且所有獲得接合子的受體菌藥物敏感試驗(yàn)均顯示產(chǎn)ESBLs。本組試驗(yàn)檢測(cè)到接合性質(zhì)粒traA和trbC，陽(yáng)性率分別為55．2%（32／58）、24．1%（14／58）。提示志賀菌存在泛宿主和狹宿主性接合性質(zhì)粒，提示耐藥在志賀菌同種屬和不同種屬之間的耐藥不容忽視，這和近年來(lái)志賀菌耐藥率的提高極為密切。

志賀菌耐三代頭孢菌素的重要機(jī)制是攜帶CTX－M型ESBLs基因，該基因?qū)︻^孢噻肟水解力強(qiáng)。本組資料志賀菌頭孢噻肟耐藥率89．7%（52／58），CTX－M－1群基因檢測(cè)陽(yáng)性率69．0%，顯示其與頭孢噻肟耐藥（89．7%）高度相關(guān)，而比率的差異顯示存在其他的耐藥機(jī)制。張環(huán)等［14］的研究結(jié)果為志賀菌對(duì)三代頭孢菌素耐藥是多種機(jī)制共同作用，主要原因?yàn)镋SBLs基因，主動(dòng)外排是起作用的另一項(xiàng)因素。從另一組數(shù)據(jù)顯示福氏志賀菌OXA檢出率92．1（35／38），宋內(nèi)氏志賀菌則為0，而福氏志賀菌、宋內(nèi)氏志賀菌氨芐西林／舒巴坦耐藥率分別為92．1%、0，可見(jiàn)氨芐西林／舒巴坦耐藥與OXA相關(guān)。

β內(nèi)酰胺類基因、復(fù)方新諾明耐藥相關(guān)基因與接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座酶、插入序列、整合子基因檢測(cè)結(jié)果的指標(biāo)聚類分析顯示，β內(nèi)酰胺類基因OXA由intI1介導(dǎo)，SHV由IS26、tnp513介導(dǎo)。而SHV、IS26、tnp513、qacE、IS903均有可能在trbC 寬范圍宿主質(zhì)粒上，能夠在不同種屬的細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移元件，造成耐藥性的播散。

可移動(dòng)遺傳元件可致多種類細(xì)菌呈多藥耐藥［9－10］，在志賀菌中的檢測(cè)國(guó)內(nèi)未曾報(bào)道，特別是對(duì)14種耐藥相關(guān)基因的聯(lián)合檢測(cè)。細(xì)菌耐多藥是多方面的原因所致，本組志賀菌因?yàn)閿y帶獲得性耐藥基因和可移動(dòng)遺傳元件導(dǎo)致多重耐藥，可移動(dòng)元件的水平轉(zhuǎn)移使細(xì)菌的耐藥性得以在同種甚至不同菌株間快速傳播，是近年來(lái)志賀菌耐藥率高的原因之一。

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