李一帆，崔柳青，韓 康，薛樂勛#

1)鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室 鄭州 450001 2)河南工業(yè)大學生物工程學院 鄭州 450001

葉綠體基因工程是高效表達外源蛋白的有效途徑之一，與核轉(zhuǎn)化相比，其具有基因拷貝數(shù)多、表達率高、遺傳性狀穩(wěn)定、能夠避免基因沉默等明顯的特點[1]。翻譯效率是決定表達能力的關(guān)鍵因素，一些翻譯增強序列能明顯提高重組蛋白的表達[2]。T7噬菌體基因10前導序列(UUAACUUUA)已經(jīng)被證實在大腸桿菌中可以作為一種翻譯增強序列來提高翻譯效率，但是還未見在植物和藻類中的報道[3]。Lux Ct是以熒光素酶基因Lux AB為基礎進行適當改造而成，含有高效的內(nèi)源性atpA基因啟動子及5’UTR和3’UTR[4]。Mayfield等[5]用 atpA啟動子-atpA 5’UTR-gfp基因-rbcL3’UTR組合表達盒在萊茵衣藻葉綠體中成功表達了綠色熒光蛋白。Canstatin是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種血管生成抑制因子，它通過誘導內(nèi)皮細胞凋亡而抑制腫瘤生長[6]。在該研究中，作者嘗試構(gòu)建一種含有翻譯增強序列的人canstatin杜氏鹽藻葉綠體重組表達載體，以期為進一步研究外源蛋白在杜氏鹽藻葉綠體中的表達打下基礎。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒、載體和主要試劑Lux Ct質(zhì)粒由SP Mayfield 饋贈，大腸桿菌DH5α為該研究室保存，PMD18-T載體購自大連寶生物(TaKaRa)公司，限制性內(nèi)切酶PaeR7Ⅰ、SphⅠ購自NEB公司，LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、AMP、IPTG和X-GAL均購自TaKaRa公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司，AMV First Strand cDNA Synthesis 試劑盒購自Fermentas公司，DNA片段膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3人canstatin基因的RT-PCR擴增采用Trizol試劑提取法提取人非小細胞肺癌A549細胞總RNA，以獲得的RNA為模板，用AMV First Strand cDNA Synthesis試劑盒合成cDNA 的第一鏈。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增，擴增不添加翻譯增強序列的人canstatin。擴增在5’UTR 下游添加翻譯增強序列的人canstatin時所用引物為canstatin F1和canstatin R；擴增在3’UTR上游添加翻譯增強序列的人canstatin時所用引物為canstatin F和canstatin R1。反應條件均為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取20 μL反應產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果。

1.4克隆載體PMD18-T/Can的構(gòu)建及鑒定分別膠回收目的片段，與PMD18-T載體按物質(zhì)的量的比15于16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。藍白斑篩選，挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定。

1.5canstatin葉綠體表達載體的構(gòu)建及酶切鑒定

用限制性內(nèi)切酶PaeR7Ⅰ、SphⅠ分別對Lux Ct和PMD18-T/Can進行雙酶切，分別回收載體片段和目的片段。利用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑選單克隆，提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定。

2 結(jié)果

2.1未添加及添加翻譯增強序列的人canstatin基因片段的擴增結(jié)果RT-PCR所得片段約為700 bp，與預期片段大小基本一致(圖1)。

圖1 人canstatin RT-PCR擴增結(jié)果

2.2PMD18-T/Can的酶切鑒定PMD18-T/Can經(jīng)PaeR7Ⅰ、SphⅠ雙酶切，得到一條載體片段和一條插入片段，插入片段與回收片段大小一致(圖2)。

圖2 pMD18-T/Can的酶切鑒定

2.3人canstatin葉綠體重組表達載體的酶切鑒定

Lux Ct質(zhì)粒經(jīng)PaeR7Ⅰ、SphⅠ雙酶切，得到2條片段，小片段大小約為2 100 bp，大片段約為10 000 bp(圖3)。將大片段進行回收，與PMD18-T/Can雙酶切所得的載體片段連接，得人canstatin葉綠體重組表達載體。該重組質(zhì)粒經(jīng)PaeR7Ⅰ、SphⅠ雙酶切，得到一條載體片段和一條插入片段，插入片段大小約為700 bp，與預期的人canstatin基因大小以及在5’UTR 下游、3’UTR上游添加翻譯增強序列的人canstatin基因片段基本一致，表明3個片段均成功插入(圖4)。

圖3 Lux Ct的酶切鑒定

圖4 人canstatin葉綠體重組表達載體的酶切鑒定

3 討論

在全球范圍內(nèi)人們對藥用蛋白的需求量劇增的形勢下，天然來源的藥用蛋白已經(jīng)遠遠不能滿足需求。目前，許多蛋白表達系統(tǒng)用于生物制品的生產(chǎn)時都具有一定的缺陷，例如陸生植物已被證明能生產(chǎn)各種生物制品、抗體等，但周期過長[7]。近年來，葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)取得了巨大進步，利用植物葉綠體生產(chǎn)外源蛋白已引起關(guān)注，尤其是生產(chǎn)藥用蛋白、口服疫苗等[8]。單細胞真核生物杜氏鹽藻作為一種理想的生物反應器，含有一個大型的杯狀葉綠體。與陸生植物相比，它培養(yǎng)簡單、抗逆性佳、生長快并且能夠大大減少從最初轉(zhuǎn)化到蛋白表達的時間[9]。這眾多優(yōu)點都使杜氏鹽藻具備了成為新型生物反應器來生產(chǎn)外源生物活性物質(zhì)的巨大潛能。

人canstatin能夠有效抑制新生血管形成和抑制腫瘤生長，目前這種被稱為“休眠療法”的腫瘤治療在臨床應用上具有廣闊前景[10]。該研究以特異高效啟動子atpA構(gòu)建載體來表達人canstatin基因。并設計利用T7噬菌體g10-L序列在不同位置來提高其表達水平，為建立一個高效表達有活性外源蛋白的葉綠體轉(zhuǎn)化體系打下實驗基礎。

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[8]崔柳青,李一帆,潘衛(wèi)東.葉綠體基因工程研究進展[J]．生物技術(shù)通報，2012(6):1

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[10]馮書營,谷輝輝,劉紅濤,等.人canstatin基因轉(zhuǎn)化新型生物反應器-杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)的初步研究[J]．中國生物工程雜志,2008, 28(6):55