楊瑞鳳，王建生，張宛哲，趙瑛瑛，孟晶茜，申鵬霄，張文吉

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科 鄭州 450014

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常見的并發(fā)癥，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一[1]，其確切的發(fā)病機制尚未完全清楚，目前治療效果不理想。活性維生素D3的生物學(xué)作用廣泛，其功能研究集中在調(diào)節(jié)鈣磷代謝、細胞增生與分化、骨的再建及免疫調(diào)節(jié)[2]方面，近年來活性維生素D3的腎保護作用越來越受關(guān)注。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)高表達是導(dǎo)致糖尿病腎損害的重要環(huán)節(jié)。骨形成蛋白-7(bone morphogenetic protein-7, BMP-7)又稱成骨蛋白-1，屬轉(zhuǎn)化生長因子超家族，能促進新骨的生成及修復(fù)，促進成骨細胞與軟骨細胞的分化，是重要的腎保護因子，可通過抑制TGF-β1發(fā)揮抗腎纖維化作用[3]。作者觀察了活性維生素D3對糖尿病大鼠腎臟BMP-7和TGF-β1表達的影響，探討活性維生素D3腎臟保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司；骨化三醇，上海羅氏公司；全自動生化儀(日立7600-010)；兔抗大鼠BMP-7多克隆抗體，北京博奧森公司；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體，Santa Cruz公司；Trizol及RT-PCR試劑盒，北京全式金生物有限公司；免疫組化試劑盒及免疫熒光試劑盒，北京中杉金橋生物工程有限公司。

1.2實驗分組雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量225～275 g，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供。大鼠禁食不禁飲12 h后，隨機取24只一次性腹腔注射60 mg/kg STZ(STZ用0.1 mmol/L無菌枸櫞酸緩沖液配制，pH4.5)[4]，72 h后尾靜脈取血測血糖，血糖>16.7 mmol/L者為糖尿病大鼠，共造模成功22只。將22只大鼠隨機分成糖尿病模型(DM)組，活性維生素D3(DC)組，每組各11只。余12只大鼠隨機選取11只為正常對照(NC)組。DC組在模型建立后，將骨化三醇溶于0.05 mL花生油以0.03 μg/(kg·d)的劑量灌胃[5]，NC組與DM組給予等量的花生油灌胃。實驗期間大鼠均給予標(biāo)準飲食，自由飲水，12 h光照周期，12周后處死，期間每組各死1只。處死前收集4～6 mL靜脈血、24 h尿。切取雙側(cè)腎臟，稱重，計算腎臟肥大指數(shù)，腎臟肥大指數(shù)=腎質(zhì)量/體質(zhì)量。取部分腎組織常規(guī)制片，其余腎組織液氮保存。

1.3腎組織形態(tài)學(xué)觀察常規(guī)石蠟切片，PAS及Masson染色，觀察腎小球基底膜、系膜區(qū)、腎小管及腎間質(zhì)的改變。

1.4生化指標(biāo)檢測采用全自動生化儀檢測24 h尿蛋白定量、血鈣(Ca)、血尿素氮(BUN)、胱抑素C(Cys-C)、血肌酐(Scr)。

1.5腎組織BMP-7、TGF-β1mRNA的檢測采用RT-PCR法檢測。取約100 mg腎皮質(zhì)按照Trizol說明書提取總RNA，取5 μg反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR擴增。引物由北京博大泰克公司合成。BMP-7引物序列：上游5’-AAACAGCAGCAGTGACCAGA-3’，下游5’-GTCGTCGAAGTAGAGGACAGATA-3’，退火溫度55 ℃，擴增產(chǎn)物長度為274 bp；TGF-β1引物序列：上游5’-CATCCCGCCCACTTTCTAC-3’，下游5’-CAAGCAGGTCACCATTTCA-3’ ，退火溫度54 ℃，擴增產(chǎn)物長度1 759 bp；β-actin引物序列：上游5’-CCCATCTATGAGGGTTAC-3’，下游5’-GGAAGGTG GACAGTGAG-3’，退火溫度58 ℃，擴增產(chǎn)物長度568 bp。產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用紫外線投射儀觀察，用凝膠成像分析系統(tǒng)測定條帶的吸光度，以目的基因與內(nèi)參條帶吸光度的比值表示目的基因mRNA的表達水平。

1.6腎組織BMP-7、TGF-β1蛋白的檢測石蠟切片脫蠟水化后，用體積分數(shù)3% H2O2處理內(nèi)源性過氧化氫酶，抗原熱修復(fù)，山羊血清封閉后，分別滴加兔抗大鼠BMP-7多克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(均按100倍稀釋)。37 ℃孵化30 min，4 ℃過夜。加入生物素二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照。陽性信號為棕黃色著色。應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司)做半定量分析，每個切片測定20個含腎小球的視野(×200)，測定陽性區(qū)積分光密度值，取均值作為最終結(jié)果。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，3組間腎臟肥大指數(shù)、生化指標(biāo)、腎組織中TGF-β1和BMP-7 mRNA及蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1腎組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)見圖1。NC組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清楚，基底膜厚度均一，毛細血管腔開放良好,間質(zhì)未見炎性細胞浸潤、纖維組織增生。DM組腎小球體積明顯增大，基底膜增厚,系膜基質(zhì)明顯增多，部分毛細血管襻融合、擴張，部分腎小管上皮細胞腫脹，腎間質(zhì)可見大量的淋巴細胞浸潤，纖維成分明顯增多。DC組系膜細胞及基質(zhì)增生減輕，病變較DM組減輕。

圖1 3組大鼠腎組織病理改變(×400)

2.2 3組大鼠腎臟肥大指數(shù)及生化指標(biāo)的比較見表1。

表1 3組腎臟肥大指數(shù)、24 h尿蛋白定量、血Ca、血BUN、Cys-C及Scr的比較

*：與NC組比較，P<0.05；#：與DM組比較,P<0.01。

2.3 3組大鼠腎組織BMP-7、TGF-β1mRNA的表達見圖2、表2。

2.4 3組大鼠腎組織BMP-7、TGF-β1蛋白的表達見圖3、表3。

圖2 3組大鼠腎組織BMP-7、TGF-β1 mRNA的表達

表2 3組腎組織中BMP-7、TGF-β1 mRNA的表達

*：與NC組比較,P<0.05;#：與DM組比較,P<0.05。

圖3 3組大鼠腎組織BMP-7、TGF-β1蛋白的表達(×200)

表3 3組腎組織BMP-7、TGF-β1蛋白表達

*:與NC組比較,P<0.05;#:與DM組比較,P<0.05。

3 討論

中國糖尿病流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國已超過印度成為世界上糖尿病患者最多的國家[6]，DN患病率也逐年增加，在我國已成為導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因。目前DN的防治手段有限，主要為對癥治療，探索新的治療方法日趨迫切。

越來越多的研究[7]表明活性維生素D3不僅具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝作用，而且還具有抗增殖、抗分化、調(diào)節(jié)細胞凋亡、介導(dǎo)免疫反應(yīng)等腎臟保護作用，但其具體作用機制尚不完全清楚。已證實TGF-β1可通過抑制細胞增殖、促進腎組織肥大、誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)表達等多種途徑導(dǎo)致糖尿病腎組織病理改變。Aschenbrenner等[8]研究證實，活性維生素D3可以通過抑制TGF-β1信號途徑Smads通路，有效延遲Fisher-Lewis慢性同種異體移植模型大鼠慢性移植腎病的發(fā)生。維生素D3還可以顯著抑制系膜增生性腎炎模型大鼠腎組織中TGF-β1的表達以及Ⅰ型、Ⅳ型膠原和α平滑肌肌動蛋白的表達，抑制系膜細胞的增殖和腎小球的硬化[9]。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)維生素D3可抑制維生素D受體敲除糖尿病模型大鼠RAS系統(tǒng)及系膜細胞、近球細胞中TGF-β1的表達，進而減少尿蛋白，抑制腎小球肥大及腎小球硬化。該研究結(jié)果顯示，DM組大鼠腎組織TGF-β1 mRNA及蛋白的表達較NC組明顯升高，DC組大鼠腎組織中TGF-β1 mRNA及蛋白的表達均較DM組明顯下降，同時尿蛋白明顯減少，病理改變減輕，表明活性維生素D3可通過下調(diào)TGF-β1表達在DN發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮保護作用。

BMP-7與TGF-β1雖同屬轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員，但作用完全不同，BMP-7可拮抗TGF-β1引起的纖維化及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]，是腎臟保護因子，在多個器官中均發(fā)揮著重要作用，若腎臟早期發(fā)育中缺乏BMP-7會導(dǎo)致腎單位發(fā)育停止。Wang等[12]發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)BMP-7基因的糖尿病大鼠中，BMP-7不僅可通過抑制足細胞的脫落而減少尿蛋白，而且可減少膠原蛋白Ⅰ及纖連蛋白的表達,從而延緩腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。該研究結(jié)果顯示：無論是在RNA水平還是蛋白水平，DM組腎組織BMP-7的表達均較NC組明顯減少，提示BMP-7對糖尿病腎組織具有重要作用，其減少可能加重糖尿病腎臟損害；與DM組相比，DC組大鼠腎臟肥大指數(shù)下降，腎臟病理改變明顯減輕，24 h尿蛋白明顯減少，血肌酐及尿素氮下降，提示活性維生素D3亦可通過上調(diào)腎組織中BMP-7的表達而發(fā)揮腎保護作用。

維生素D缺乏在DN患者中普遍存在，1,25(OH)2D3較25(OH)D3缺乏更明顯[13]。該研究結(jié)果顯示，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎組織中BMP-7表達減少，TGF-β1表達增加，而活性維生素D3在糖尿病腎病中發(fā)揮腎臟保護作用，其作用機制可能與上調(diào)BMP-7、下調(diào)TGF-β1的表達密切相關(guān)，但對于活性維生素D3通過何種途徑發(fā)揮上述作用，還有待進一步研究。

[1]黎磊石, 劉志紅. 中國腎臟病學(xué)[M]. 北京: 人民軍醫(yī)出版社, 2008:626

[2]Holick MF. Vitamin D: a millenium perspective[J]. J Cell Biochem, 2003, 88(2):296

[3]Phillips AO，F(xiàn)raser DJ. BMP-7 stops TGF-β in peritoneal fibrosis[J]. Nephrol Dial Transplant, 2010, 25(4):1036

[4]李青菊, 姚蔚, 李鳳良，等. 褪黑素對早期糖尿病大鼠心肌非酶糖基化及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版, 2005, 40(3):488

[5]劉雷, 甘華, 王輝，等. 活性維生素D3對糖尿病大鼠腎臟TGF-β1及HGF表達的影響[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2008, 33(9):1058

[6]Yang SH, Dou KF, Song WJ.Prevalence of diabetes among men and women in china[J]. N Engl J Med, 2010, 362(25):2425

[7]陳兆聰. 維生素D再認識[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報, 2011, 30(5):555

[8]Aschenbrenner JK, Sollinger HW, Becker BN, et al. 1,25-(OH(2))D(3) alters the transforming growth factor beta signaling pathway in renal tissue[J]. J Surg Res, 2001, 100 (2):171

[9]Panichi V,Migliori M,Taccola D, et al. Effects of 1,25-(OH)2D3 in experiment mesangial proliferative nephritis in rats[J]. Kidney Int, 2001, 60 (1):87

[10]Zhang Z,Sun L,Wang Y,et al.Renoprotective role of the vitamin D receptor in diabetic nephropathy[J].Kidney Int,2008,73(2):163

[11]Veerasamy M, Nguyen TQ, Motazed R, et al.Differential regulation of E-cadherin and alpha -smooth muscle actin by BMP-7 in human renal proximal tubule epithelial cells and its implication in renal fibrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol,2009,297(5):F1238

[12]Wang SN,de Caestecker M,Kopp J,et al. Renal bone morphogenetic protein-7 protects against diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol, 2006, 17(9):2504

[13]Levin A,Le Barbier M,Er L, et al. Incident isolated 1,25-(OH)2D3 deficiency is more common than 25(OH)D deficiency in CKD[J]. J Nephrol, 2012, 2(25):204