高秀艷，宋士軍，崔 同，王騰騰，李朝蘋(píng)，田 粟#

1)河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 石家莊 050017 2)河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 石家莊 050017 3)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 保定 071001

隨著人口的老齡化以及現(xiàn)代人生活習(xí)慣的改變，人群疾病模式已由傳染性疾病轉(zhuǎn)變到以慢性病為主，其中心血管疾病是威脅人類(lèi)健康的最常見(jiàn)的慢性疾病，而長(zhǎng)期高血壓是心血管疾病死亡的重要原因。目前的研究認(rèn)為改變生活習(xí)慣和藥物治療是預(yù)防和治療高血壓的有效方法。日常飲食中蔬菜、水果、紅酒、茶等[1-2]被證明能較好地預(yù)防和控制高血壓，其降壓作用主要?dú)w功于其中的多酚類(lèi)化合物。多酚類(lèi)化合物主要包括類(lèi)黃酮和酚酸，其降血壓的機(jī)制是通過(guò)降低血管的氧化壓力[3]和舒張血管[1]實(shí)現(xiàn)的。目前國(guó)內(nèi)對(duì)多酚類(lèi)化合物舒張血管作用的研究多聚焦于中草藥的粗提物[4-7]，有關(guān)某一具體活性成分對(duì)血管舒張作用的報(bào)道還尚少見(jiàn)。阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)是植物中普遍存在的一種酚酸，因其具有較強(qiáng)的抗氧化活性而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、保健品等行業(yè)。近年來(lái)，通過(guò)大量的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究[8-10]發(fā)現(xiàn)FA及其衍生物具有抗血栓、降血脂、消炎、防癌等生物活性。該研究評(píng)價(jià)了FA對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑及實(shí)驗(yàn)儀器去氧腎上腺素(L-phenylephrine hydrochloride，PE)、氯化乙酰膽堿(acetylcholine chloride，ACH)、L-亞硝基精氨酸甲基酯(NG-nitro-L-arginine methylester，L-NAME)、吲哚美辛(indomethacin，Indo)、格列苯脲(glibenclamide，Gli)、四乙基胺(tetraethylammonium，TEA)、二甲基亞砜(DMSO)、FA均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；亞甲藍(lán)(methylene blue，MB)、維拉帕米購(gòu)自美國(guó)ACROS公司；Krebs-henseleit (K-H)液由NaCl 118.00、KCl 4.70、CaCl22.52、MgSO4·7H2O 1.40、NaHCO324.20、KH2PO41.18 和葡萄糖11.00 mmol/L組成，均購(gòu)自天津博迪化工股份有限公司。SQG-4四腔器官浴槽系統(tǒng)、HSS-1(B)型恒溫水浴槽、BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都儀器廠)；Sartorius CP124S電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)。

1.2胸主動(dòng)脈環(huán)的制備

1.2.1 胸主動(dòng)脈環(huán)的制備與穩(wěn)定 清潔級(jí)Wistar大鼠，220～270 g，雄性，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠頸椎脫臼處死后，取出胸主動(dòng)脈，剔除血管周?chē)M織，將其剪成長(zhǎng)約3 mm的動(dòng)脈環(huán)，避免過(guò)度牽拉及損傷致動(dòng)脈失活。置于通以體積分?jǐn)?shù)95%O2+體積分?jǐn)?shù)5%CO2混合氣體的K-H液中，一端通過(guò)掛環(huán)固定，另一端經(jīng)張力換能器與生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)相連，保持37 ℃恒溫，調(diào)節(jié)靜息張力至1 g，穩(wěn)定平衡40 min，期間每隔20 min換液1次。

1.2.2 血管內(nèi)皮活性和完整性檢測(cè) 待動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定后，向浴槽中加入10 mmol/L PE，動(dòng)脈收縮張力≥300 mg，判斷為有活性。當(dāng)動(dòng)脈環(huán)收縮達(dá)到平臺(tái)(約10 min)后，加入10 mmol/L ACH，收縮的血管舒張≥70%時(shí)，可認(rèn)為血管內(nèi)皮完整，反之，則認(rèn)為已去內(nèi)皮處理(即用鐵絲穿過(guò)血管腔，對(duì)血管內(nèi)表面進(jìn)行摩擦)。檢測(cè)完畢后用K-H液連續(xù)沖洗浴槽3次，去除PE 和ACH的影響，穩(wěn)定動(dòng)脈環(huán)，待基線平穩(wěn)后，開(kāi)始以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 血管張力 以加入藥物后的血管張力變化幅度與PE誘發(fā)最大收縮幅度之間的比率×100%反映血管張力的變化。

1.3FA對(duì)PE、KCl預(yù)收縮的大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用使用內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮的動(dòng)脈環(huán)，向浴槽中分別加入10 mmol/L PE、60 mmol/L KCl，收縮達(dá)到平臺(tái)后累積加入FA至0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol/L，加藥間隔為7 min，記錄張力變化。每組均取8個(gè)動(dòng)脈環(huán)。

1.4L-NAME、Indo、MB、Gli、TEA、維拉帕米對(duì)FA舒張大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)作用的影響取內(nèi)皮完整動(dòng)脈環(huán)，向浴槽中分別加入100 μmol/L L-NAME、10 μmol/L Indo、10 μmol/L MB、10 μmol/L Gli、10 μmol/L TEA、1 μmol/L 維拉帕米預(yù)處理20 min后，加入PE預(yù)收縮動(dòng)脈環(huán)，待平衡后分別加入終濃度為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol/L的FA，記錄張力變化，加藥間隔7 min。每組均取8個(gè)動(dòng)脈環(huán)。

1.5FA對(duì)平滑肌細(xì)胞外鈣內(nèi)流的影響用無(wú)Ca2+的K-H液沖洗動(dòng)脈環(huán)3次，孵育15 min后，分別加入1、4和10 mmol/L FA，15 min后加入10 mmol/L PE，收縮達(dá)到平臺(tái)后，累積加入CaCl2溶液至浴槽中，使Ca2+濃度達(dá)到0.01、0.10、1.00、10.00 mmol/L，分別記錄張力變化。每組均取8個(gè)動(dòng)脈環(huán)。

1.6FA對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的影響用無(wú)Ca2+的K-H液沖洗3次后，孵育15 min，記錄基礎(chǔ)張力并加入10 mmol/L PE達(dá)到收縮平衡，張力的變化記為T(mén)1；繼而用含Ca2+的K-H液沖洗3次，孵育≥40 min，再用無(wú)Ca2+的K-H液沖洗3次，孵育15 min，分別加入1、4和10 mmol/L FA，15 min后記錄張力并加入10 mmol/L PE達(dá)到收縮平臺(tái)，張力的變化記為T(mén)2。T2/T1表示FA對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的影響。每組均取8個(gè)動(dòng)脈環(huán)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理半數(shù)有效濃度(EC50)的計(jì)算用直線回歸法，親和力指數(shù)pD2為EC50的對(duì)數(shù)倒數(shù)。采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，兩組定量資料的比較用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)(數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，但方差不齊)，多組間定量資料比較用單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)(數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，但方差不齊)，組間兩兩比較用SNK或Dunnet-t檢驗(yàn)，F(xiàn)A對(duì)細(xì)胞外鈣的影響采用4×4析因設(shè)計(jì)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1FA對(duì)PE、KCl預(yù)收縮的大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用FA對(duì)PE預(yù)收縮的大鼠離體的內(nèi)皮完整胸主動(dòng)脈環(huán)張力的影響見(jiàn)圖1。FA對(duì)PE、KCl預(yù)收縮的內(nèi)皮完整胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張效果均有濃度依賴性(表1)。兩者的EC50分別為(2.43±0.52)和(2.17±0.15) mmol/L，pD2分別為(2.62±0.08)和(2.66±0.03) mol/L，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.858，P=0.391)。FA對(duì)PE預(yù)收縮的去內(nèi)皮胸主動(dòng)脈環(huán)也具有濃度依賴的舒張作用(表1)。其EC50為(2.59±0.62) mmol/L，pD2為(2.60±0.93) mol/L，與PE預(yù)收縮的內(nèi)皮完整組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.447，P=0.655)。

圖1 FA對(duì)PE預(yù)收縮大鼠離體內(nèi)皮完整的胸主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

表1 FA對(duì)PE、KCl預(yù)收縮大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用(n=8) %

E+:內(nèi)皮完整動(dòng)脈環(huán);E-：去內(nèi)皮動(dòng)脈環(huán)。

2.2L-NAME、Indo、MB、Gli、TEA及維拉帕米預(yù)處理后FA對(duì)舒張大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)作用的影響

內(nèi)皮完整動(dòng)脈環(huán)經(jīng)L-NAME、Indo、MB、Gli、TEA分別預(yù)處理后，F(xiàn)A均對(duì)PE預(yù)收縮的動(dòng)脈環(huán)表現(xiàn)出舒張作用，且隨著FA濃度的增加，舒張作用越明顯，L-NAME、Indo、MB預(yù)處理實(shí)驗(yàn)組與內(nèi)皮完整組的EC50和pD2值(表2)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.404，P=0.333)。Gli、TEA預(yù)處理組與內(nèi)皮完整組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.061，P=0.970)。伴隨FA濃度的增加，動(dòng)脈環(huán)收縮率逐漸降低，加入維拉帕米預(yù)處理后， EC50為(4.31±1.03)mmol/L，與內(nèi)皮完整組(2.43±0.52)mmol/L相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.055，P=0.005)，表明維拉帕米明顯減弱了FA對(duì)PE預(yù)收縮動(dòng)脈環(huán)的舒張作用。

表2 L-NAME、Indo、MB、Gli、TEA預(yù)處理后FA對(duì)PE預(yù)收縮大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)作用的EC50和pD2值(n=8) %

2.3FA對(duì)平滑肌細(xì)胞外鈣內(nèi)流的影響見(jiàn)表3。隨CaCl2溶液濃度的增加，對(duì)照組和不同濃度FA組均表現(xiàn)出隨之增加的收縮動(dòng)脈環(huán)的作用。

2.4FA對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的影響與對(duì)照組(1.02±0.12)相比，1、4和10 mmol/L FA均有明顯抑制細(xì)胞內(nèi)鈣的作用(0.81±0.10，0.47±0.09，0.13±0.09)(F=108.816，P<0.001)，而且隨著FA的濃度的增加，其抑制細(xì)胞內(nèi)鈣的作用越明顯。

表3 FA對(duì)平滑肌細(xì)胞外鈣內(nèi)流的影響(n=8) %

FCa2+=68.625，P<0.001；FFA=134.517，P< 0.001；F交互=0.298，P=0.974。

3 討論

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在離體條件下，F(xiàn)A可濃度依賴性舒張PE和KCl預(yù)收縮的內(nèi)皮完整的胸主動(dòng)脈環(huán)，提示FA具有一定的舒張血管的作用。將離體動(dòng)脈環(huán)經(jīng)機(jī)械摩擦去掉內(nèi)皮后，F(xiàn)A舒張血管的作用仍然存在，提示FA舒張血管作用主要是直接作用于血管平滑肌，而非依賴內(nèi)皮。

有研究[1]表明多酚類(lèi)化合物舒張血管作用的內(nèi)皮機(jī)制主要是內(nèi)皮細(xì)胞NO合酶作用于L-精氨酸釋放NO，繼而激活血管平滑肌細(xì)胞的可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(sGC)，引起環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)升高，從而產(chǎn)生舒張血管的作用。還可利用內(nèi)皮-環(huán)氧合酶(COX)-前列腺素(PG)-G蛋白途徑，使內(nèi)皮細(xì)胞中的COX催化產(chǎn)生PGI2，作用于平滑肌的IP受體，激活G蛋白和腺苷酸環(huán)化酶(AC)產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，引起平滑肌的舒張。為了進(jìn)一步驗(yàn)證FA的非內(nèi)皮依賴性的血管舒張作用，作者分別使用NO合酶抑制劑L-NAME、GC的抑制劑MB及COX的抑制劑Indo對(duì)胸動(dòng)脈環(huán)進(jìn)行預(yù)處理后，評(píng)價(jià)FA舒張血管的作用。結(jié)果表明這3種抑制劑不能阻斷FA的舒張血管作用，這與Chen等[11]的研究結(jié)果一致。

血管平滑肌的舒張與收縮受Na+、Ca2+、K+等多種離子的調(diào)節(jié)。其中，鈣通道和鉀通道是血管平滑肌細(xì)胞上最重要的離子通道，二者共同維持著血管張力的平衡。平滑肌存在鈣激活鉀通道(Kca)、ATP敏感鉀通道(KATP)、內(nèi)向整流鉀通道(inward-rectifier K+channels)、延遲整流電壓位依賴性鉀通道(delayed-rectifier voltage-dependent K+channels)。有研究[12]報(bào)道多酚類(lèi)化合物發(fā)揮舒張作用的一個(gè)重要機(jī)制是開(kāi)放了鉀通道，故作者分別選擇了KATP和Kca通道的抑制劑Gli和TEA作用于PE預(yù)收縮的內(nèi)皮完整的胸主動(dòng)脈環(huán)，結(jié)果顯示Gli和TEA未抑制FA的舒張作用，提示FA對(duì)胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用與鉀通道無(wú)關(guān)。血管平滑肌細(xì)胞膜上的鈣通道主要有L型和T型，它們直接控制鈣離子的內(nèi)流量，調(diào)節(jié)細(xì)胞的舒縮功能。平滑肌收縮是由內(nèi)貯鈣釋放和外鈣進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)使鈣離子增加所致。該實(shí)驗(yàn)觀察到，在無(wú)Ca2+的K-H液中不同濃度的FA可以劑量依賴性地抑制CaCl2誘導(dǎo)的收縮，證明其可以抑制細(xì)胞外鈣內(nèi)流。研究[13]表明,血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞外的鈣離子主要通過(guò)L-型鈣通道(ICa-L)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)加入ICa-L特異性阻斷劑維拉帕米后，F(xiàn)A舒張率較對(duì)照組明顯降低，推測(cè)其舒張血管的機(jī)制可能與阻斷ICa-L以阻止細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流有關(guān)。在無(wú)Ca2+的K-H液中預(yù)先孵育不同濃度的FA可降低PE誘發(fā)的短暫性血管收縮，表明FA阻斷了細(xì)胞內(nèi)鈣外流。但是1 mmol/L FA和4 mmol/L FA對(duì)外鈣內(nèi)流的抑制作用無(wú)差異，而在抑制內(nèi)鈣釋放時(shí)存在差異，考慮FA發(fā)揮舒張血管作用主要與抑制了細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放有關(guān)。

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