劉伯新，郭長青#，王曼華，王明榮

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052 2)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100021

MAL基因是由Alonso等[1]于1987年分離得到的一個(gè)在T細(xì)胞分化中晚期表達(dá)的基因。研究[2-4]表明MAL基因在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)或者缺失，DNA甲基化被認(rèn)為是該基因失活的可能機(jī)制之一[5-8]。該研究利用亞硫酸氫鹽測(cè)序法檢測(cè)人食管鱗狀細(xì)胞癌(食管鱗癌)細(xì)胞系EC9706中MAL基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化情況，并采用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)合PCR技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)食管鱗癌組織MAL基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況，以期對(duì)食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1材料26例食管鱗癌及其配對(duì)癌旁正常食管組織取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年1月至2011年12月住院手術(shù)患者，男22例，女4例，年齡46～74(57.2±8.3)歲。其中腫瘤直徑≥3 cm 24例，<3 cm 2例；高、中分化19例，低分化7例；侵襲深度未達(dá)肌層2例，肌或肌外層24例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移20例、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移6例。患者術(shù)前均未接受放化療，所有標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)為食管鱗癌。標(biāo)本取材后置液氮中速凍，然后置-70 ℃冰箱保存。EC9706細(xì)胞由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物和免疫學(xué)教研室提供，常規(guī)培養(yǎng)，至70%～80%飽和密度時(shí)收獲細(xì)胞。

1.2EC9706細(xì)胞MAL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)

1.2.1 基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾及純化回收

提取EC9706細(xì)胞的基因組DNA，采用蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提。DNA樣品中加入3 mol/L NaOH 42 ℃水浴30 min，加入新配制的10 mmol/L氫醌30 μL和3.6 mol/L亞硫酸氫鈉(pH 5.0)520 μL，加200 μL石蠟油，50 ℃避光水浴16 h。用Wizard DNA Clean-up System(Promega公司產(chǎn)品)純化DNA。加3 mol/L NaOH 5.5 μL，37 ℃孵育15 min，加1 μg鮭精DNA，加10 mol/L乙酸銨33 μL，再加270 μL冰無水乙醇，-20 ℃過夜沉淀，12 000 r/min離心10 min，加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇離心，空氣中干燥后加20 μL TE溶液，-20 ℃保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 MAL基因啟動(dòng)子區(qū)引物序列：上游5’-GTGGTTGGTTTTATTTTTTATTGTAGATTT-3’，下游5’-CAAAAACCACTCACAAACTCAAAAAT-3’，產(chǎn)物大小699 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中包含DNA 0.5 μL，Master Amp 2×PCR Premix buffer 12.5 μL，引物0.4 μmol/L各1 μL，Taq酶2 U(日本TaKaRa公司)。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃ 40 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 130 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后于72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用QIAEXⅡ Agarose gel extraction試劑盒回收，將終產(chǎn)物送至大連日本TaKaRa公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3食管組織MAL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)

1.3.1 DNA甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶EheⅠ酶切及純化 組織標(biāo)本采用酚-氯仿抽提法提取DNA，50 μL酶切體系內(nèi)含10×buffer 5 μL，EheⅠ 10 U，基因組DNA 1 μg，上加礦物油200 μL，37 ℃酶切過夜。吸棄礦物油，酚-氯仿抽提純化DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 MAL基因5’調(diào)控區(qū)(含啟動(dòng)子區(qū))引物序列：上游5’-TCAGTGGACGCGGAAGG-3’，下游5’-GAGCCACTCACAAACTCAAAGATC-3’，產(chǎn)物大小為724 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)同1.2.2。取10 μL上樣于1.5 g/L瓊脂糖凝膠(含0.1 g/L溴化乙錠)電泳。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用配對(duì)χ2檢驗(yàn)分析食管鱗癌及配對(duì)癌旁正常食管組織中MAL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率的差異，應(yīng)用Fisher確切概率法分析不同臨床病理因素食管鱗癌組織中MAL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1EC9706細(xì)胞MAL基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況EC9706細(xì)胞基因組DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。MAL基因啟動(dòng)子區(qū)699 bp范圍內(nèi)檢測(cè)出42個(gè)胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化，占所有CpG位點(diǎn)的73.7%(42/57)。

圖1 EC9706細(xì)胞MAL基因啟動(dòng)子區(qū)的PCR結(jié)果

2.2食管組織中MAL基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2、表1。

圖2 2種食管組織MAL基因啟動(dòng)子區(qū)PCR結(jié)果

表1 2種食管組織中MAL基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況 例

配對(duì)χ2=10.924,P<0.001。

2.3不同臨床病理特征患者食管鱗癌組織中MAL基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況見表2。

表2 不同臨床病理特征患者食管鱗癌組織中MAL基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況

3 討論

MAL基因表達(dá)一個(gè)高度疏水性蛋白，即 MAL蛋白，這個(gè)蛋白缺少一個(gè)疏水的引導(dǎo)肽序列，并包含四個(gè)被短親水片段分離開的潛在跨膜區(qū)域[1]。MAL基因可能是高爾基體和遠(yuǎn)端質(zhì)膜之間囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)分選的一個(gè)功能成分[9-11]。

許多腫瘤組織中MAL基因表達(dá)異常，基因甲基化可能是MAL基因失活的主要機(jī)制[12]。許智雄等[13]發(fā)現(xiàn)MAL基因在92.7%(38/41)食管癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，且在3個(gè)食管癌細(xì)胞株未見表達(dá)，認(rèn)為MAL基因表達(dá)下調(diào)是食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的一個(gè)頻發(fā)事件。Mimori等[14]發(fā)現(xiàn)MAL基因在食管上皮細(xì)胞的分化和角質(zhì)化中起調(diào)節(jié)作用。Zinovyeva等[15]通過cDNA序列分析和RT-PCR對(duì)人食管癌和正常食管黏膜組織進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)MAL基因在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。郭長青等[8]對(duì)食管癌MAL基因表達(dá)下調(diào)機(jī)制進(jìn)行了探討，對(duì)MAL基因的5’調(diào)控區(qū)進(jìn)行克隆和序列分析，結(jié)果表明食管癌中可能存在MAL基因5’調(diào)控區(qū)的點(diǎn)突變。根據(jù)以上研究推測(cè)MAL基因啟動(dòng)子區(qū)可能存在甲基化，這可能是食管癌MAL基因表達(dá)下調(diào)的機(jī)制之一。

該研究發(fā)現(xiàn)在EC9706細(xì)胞中MAL基因啟動(dòng)子區(qū)有42個(gè)CpG位點(diǎn)的胞嘧啶發(fā)生了甲基化，占所有CpG位點(diǎn)的73.7%(42/57)，提示MAL基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化可能導(dǎo)致MAL基因轉(zhuǎn)錄沉默。該研究亦發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中MAL基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率高于癌旁正常食管組織，不同臨床病理特征患者食管鱗癌組織中MAL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，在食管黏膜的癌變過程中MAL基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島可能發(fā)生了甲基化，導(dǎo)致MAL基因的轉(zhuǎn)錄沉默，表達(dá)水平顯著下調(diào)，從而導(dǎo)致食管黏膜癌變的發(fā)生。

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