羅 波，段素群，鄭小莉，毛櫻逾

1)瀘州醫(yī)學院生物化學教研室 瀘州 646000 2)瀘州醫(yī)學院教務處 瀘州 646000 3)瀘州醫(yī)學院病原生物學教研室 瀘州 646000

現(xiàn)已公認，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宮頸癌的主要發(fā)病因素，HPV感染與95%以上宮頸癌的發(fā)生有關[1]，尤其其中的16型(HPV16)是宮頸癌的首要啟動因素，檢出率約50%[2]。防治HPV感染對預防宮頸癌，減少宮頸癌的危害有重要作用。但是，HPV感染的治療目前還沒有特別有效的手段，治療常常不徹底，易反復發(fā)作，治療費用昂貴。因此，用HPV疫苗來預防HPV感染及由其引起的宮頸癌有重要應用價值。該研究擬從培養(yǎng)的宮頸癌細胞系中通過PCR方法獲得HPV16 L1衣殼蛋白基因，連接到乳酸桿菌分泌表達載體pVE5523上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10中保存，為將來制備可以分泌表達HPV16 L1抗原蛋白的重組乳酸桿菌，開發(fā)臨床實用的生殖道HPV生物疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料電泳儀購自Bio-Rad公司，CasKi宮頸癌細胞株購于北京腫瘤防治研究所，DMEM培養(yǎng)基購于Sigma公司，胎牛血清購于華南理工大學，cDNA合成試劑盒購自Toyobo公司，細胞基因組DNA提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，2×Taq PCR MasterMix、TIANprep Mini 質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和SalⅠ、T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品，pVE5523質(zhì)粒、Top10菌種為瀘州醫(yī)學院病原生物學教研室保存。其他主要試劑為進口產(chǎn)品或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2CasKi宮頸癌細胞株DNA的提取培養(yǎng)、收集CasKi細胞，按細胞基因組DNA提取試劑盒說明書的操作步驟提取DNA樣品。

1.3引物的設計與合成根據(jù) GenBank中東亞型HPV16全基因序列(基因登錄號AF534061)設計擴增HPV16 L1基因的上、下游引物。上游引物5’-GCGGTCGACATGCAGGTGACTTTTATTTACA-3’，下游引物5’-GCGGATATCTAAAAATTTGCGTCCTAA AG-3’。上、下游引物5’端分別設有SalⅠ和EcoRⅤ酶切位點，目的片段長度為1 485 bp，引物合成由上海Invitrogen生物工程公司完成。

1.4目的基因的PCR擴增以提取的CasKi宮頸癌細胞株DNA為模板克隆HPV16 L1基因。25 μL PCR擴增體系：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，H2O 9.5 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性4 min，進行30個循環(huán)(變性94 ℃ 30 s，退火53 ℃ 35 s，延伸72 ℃ 1.5 min)，最后72 ℃ 10 min后終止反應。PCR產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

1.5HPV16L1乳酸桿菌表達載體的構建HPV16 L1的PCR產(chǎn)物和pVE5523質(zhì)粒分別用EcoRⅤ和SalⅠ雙酶切，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，進行膠回收HPV16 L1和pVE5523，用T4連接酶16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Top10，用含100 mg/L 氨芐青霉素及100 mg/L 紅霉素的平板來篩選陽性克隆。陽性克隆經(jīng)PCR鑒定，獲得初步正確的克隆。將該克隆送TaKaRa公司測序。

2 結果

2.1HPV16L1基因的PCR擴增以提取的CasKi宮頸癌細胞株DNA為模板，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，在2 000與1 000 bp中間處有一明顯條帶，大小與預期值相符(1 485 bp)，見圖1。

圖1 HPV16 L1基因PCR擴增結果

2.2HPV16L1-pVE5523重組表達質(zhì)粒的鑒定挑取轉(zhuǎn)化后的陽性克隆，經(jīng)PCR鑒定，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見在2 000與1 000 bp中間處有一明顯條帶，大小與預期值相符(1 485 bp)，見圖2。

圖2 陽性克隆的PCR鑒定結果

M：Marker；1，2，4，5，7，10，12：假陽性克隆的擴增產(chǎn)物；3，6，8，9，11，13：陽性克隆的擴增產(chǎn)物。

2.3重組質(zhì)粒的序列測定及分析將陽性克隆菌6、11號提取質(zhì)粒后進行序列測定，結果顯示重組質(zhì)粒中插入的目的片段HPV16 L1基因與GenBank公布的序列相同，而且HPV16 L1基因插入的方向正確，未改變外源基因的閱讀框架。

3 討論

宮頸癌是世界范圍內(nèi)常見的婦科惡性腫瘤之一，占女性癌癥發(fā)病率第2位，病死率第3位。據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有50萬人被診斷為宮頸癌，約20多萬人因此而喪生[3]。HPV是一類感染表皮和黏膜鱗狀上皮的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，按照HPV感染與發(fā)生宮頸癌的潛在危險性，將HPV分為低危型(HPV1、HPV6、HPV11等)和高危型(HPV16、HPV18、HPV31、HPV45等)兩類。高危型HPV與宮頸癌的發(fā)生有著密切的因果關系[4-6]。研究高效、價廉的HPV疫苗來預防宮頸癌，降低宮頸癌防治的成本，對降低宮頸癌的危害具有重要意義。

重組載體疫苗是新興現(xiàn)代疫苗的重要發(fā)展方向。它是將病原體抗原DNA片段轉(zhuǎn)入減毒病原菌或共生菌中制成疫苗，接種人體后，可在人體增殖，持續(xù)表達所編碼的抗原，誘發(fā)機體免疫應答，具有免疫效力高、成本低及滅活疫苗的安全性好等優(yōu)點。乳酸桿菌是女性陰道內(nèi)的優(yōu)勢菌，對維護女性陰道的自凈作用及防御外來病原體的感染、增強機體抵抗力和免疫力具有明顯的作用，且無病原性的特點。因此，乳酸桿菌非常適宜作為安全的人體疫苗和其他病原體的抗原載體。但是一直以來對乳酸桿菌的遺傳和分子生物學研究進展較為緩慢，對乳酸桿菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)研究不夠深入，與其他醫(yī)藥微生物基因工程研究相比，乳酸桿菌基因工程研究進展緩慢。pVE5523載體是近年來Dieye等[7]構建的能在乳酸桿菌中分泌表達外源性基因的一種表達載體，具有較廣泛的應用范圍。

該研究選擇HPV16的L1衣殼蛋白基因作為目的基因，已經(jīng)成功連接到pVE5523質(zhì)粒中，構建了HPV16 L1-pVE5523載體。通過PCR、測序等方法驗證了其正確性，為下一步研制HPV16 L1的乳酸桿菌重組載體疫苗提供了有力支持。

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