黃麗艷，王 娜，湯黎明，許 燕，黃幼田，楊紅艷，董子明#

1)遼寧醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生所 錦州 121001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 鄭州 450001

食管癌是一種常見的惡性腫瘤，5 a生存率僅為20%左右。食管癌的病因和發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，研究[1-3]發(fā)現(xiàn)其與控制細(xì)胞生命活動的重要基因密切相關(guān)，包括原癌基因、抑癌基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因異常等。PTEN(Phosphates and Tension homolog deleted on chromosome Ten)是1997年從原發(fā)性乳癌、前列腺癌以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株分離的新型抑癌基因[4]。學(xué)者[5-7]研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因在食管癌組織中表達(dá)顯著降低，PTEN蛋白表達(dá)與食管癌大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分期呈負(fù)相關(guān)，提示PTEN低表達(dá)可能是導(dǎo)致食管癌發(fā)病的一個重要因素。作者分別構(gòu)建了PTEN siRNA載體和真核表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞獲得PTEN沉默細(xì)胞株和PTEN高表達(dá)細(xì)胞株，觀察2株細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡等，探討食管癌細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平對細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。

1 材料與方法

1.1材料EC9706(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院保存)。pRNAT-U6.1載體(美國GenScript公司)。pcDNA3.1，LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)。質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)。小量總RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)。RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清(美國Gibco公司)。熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物公司)。鼠抗PTEN單克隆抗體、鼠抗GAPDH單克隆抗體、山羊抗鼠IgG-HRP抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2PTENsiRNA載體的構(gòu)建依據(jù)PTEN mRNA序列(NM_000314)，篩選確定靶向PTEN基因的2個siRNA序列，即1 311～1 329位和1 412～1 430位，合成2對發(fā)卡樣單鏈DNA。si1 311-1序列：5’-GATCCGCCCACCACAGCTAGAACTTCTCAAGAGAAAGCACCACAGCTAGAACTTCTAGCTGTGGTGGGTTTTTT GGAAA-3’，si1 311-2序列：5’-AGCTTTTCCAAAA AACCTTTCTCTTGAGAAGTTCTAGCTGTGGTGGGCG-3’；si1 412-1序列：5’-GATCCAGGGACGAACTGG TGTAATTTCAAGAGAATTACACCAGTTCGTCCCTTTT TTTGGAAA-3’，si1 412-2序列：5’-AGCTTTTCCAA AAAAAGGGACGAACTGGTGTAATTCTCTTGAAATTA CACCAGTTCGTCCCTG-3’。序列兩端加上HindⅢ和BamHⅠ內(nèi)切酶殘基，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。常規(guī)退火后分別與HindⅢ和BamHⅠ雙黏siRNA載體pRNAT-U6.1重組。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，選取2個轉(zhuǎn)化菌隔夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，對插入序列進(jìn)行測序。得到PTEN基因siRNA重組載體pRNAT-U6.1-si1 311和pRNAT-U6.1-si1 412。

1.3PTEN基因表達(dá)載體的構(gòu)建以含有PTEN基因全長cDNA的質(zhì)粒pCMV-SPORT6-PTEN為模板，引物5’添加分別HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，為PTEN1(5’-GTAAAGCTTGCCACCATGGCAGCCA TCATCAAAGAGATCG-3’)和PTEN2(5’-CTTGG ATCCTCAGACTTTTGTAATTTGTGTATGCTG-3’)，PCR擴(kuò)增PTEN基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ/BamHⅠ雙酶切純化后，與pcDNA3.1(+)重組，轉(zhuǎn)化DH5α菌。提取轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒，HindⅢ/BamHⅠ雙酶切和DNA序列分析對PTEN序列進(jìn)行鑒定，得到重組PTEN真核表達(dá)載體pcDNA3.1-PTEN。

1.4食管癌細(xì)胞株EC9706的轉(zhuǎn)染提取純化重組PTEN表達(dá)載體和siRNA載體，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期EC9706細(xì)胞。轉(zhuǎn)染分6組，沉默1組(轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-si1 311)、沉默2組(轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-si1 412)、siRNA載體對照組(轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1)、PTEN表達(dá)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PTEN)、表達(dá)載體對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)、未轉(zhuǎn)染組(不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒，僅用脂質(zhì)體處理)。轉(zhuǎn)染12 h后換液，加入含有抗生素的完全培養(yǎng)基37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)24 h進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。

1.5RT-PCR檢測EC9706細(xì)胞PTENmRNA表達(dá)使用Qiagen公司小量總RNA提取試劑盒提取各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。熒光定量PCR試劑盒擴(kuò)增，PTEN擴(kuò)增引物 5’-TGGCG GAACTTGCAATCC-3’和5’-GCTGAGGGAACTC AAAGTAC-3’；內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增引物5’-GCCTTCC GTGTCCCCACTGC-3’和 5’-CAATGCCAGCCCCA GCGTCA-3’。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性20 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。每個實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)5次，PTEN與內(nèi)參GAPDH表達(dá)量的比值為PTEN的相對表達(dá)量。

1.6Westernblot檢測EC9706細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞裂解后離心提取蛋白質(zhì)，Bradford法測定蛋白濃度。120 g/L SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，25 mL封閉緩沖液中孵育膜1 h，加入鼠抗PTEN單克隆抗體及鼠抗GAPDH單克隆抗體，孵育。洗膜后加入山羊抗鼠IgG-HRP二抗，孵育1 h。ECL顯色。成像掃描分析系統(tǒng)(Kodak Digital Science ID Image Analysis Software)保存圖像。

1.7CCK-8試驗(yàn)檢測EC9706細(xì)胞增殖取各組細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板1～5 d后，采用CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒測定細(xì)胞孔內(nèi)的吸光度(A)，計(jì)算平均值，繪制各組細(xì)胞生長曲線。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測EC9706細(xì)胞凋亡取轉(zhuǎn)染后48 h的各組細(xì)胞，胰蛋白酶充分消化，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，PBS 洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1。按照Annexin V-FITC-PI試劑盒說明書進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測，重復(fù)檢測5次。

1.9軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)取轉(zhuǎn)染24 h后處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化，輕輕吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，重懸于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中。體積比11混合12 g/L的瓊脂糖和2×RPMI 1640培養(yǎng)基(含2×抗生素和體積分?jǐn)?shù)20%的小牛血清)，平皿中冷卻凝固。體積比11混合7 g/L的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基，加入0.2 mL濃度為5×103mL-1的細(xì)胞懸液，注入鋪有12 g/L瓊脂糖底層平皿中，培養(yǎng)10～14 d取出培養(yǎng)板，于倒置顯微鏡下選取10個低倍視野，計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)。每組細(xì)胞重復(fù)5次。

1.10Transwell試驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力轉(zhuǎn)染后48 h，各組細(xì)胞調(diào)整濃度為2×105mL-1，在上室中加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含趨化因子的培養(yǎng)基。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)48 h后取出，小心用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察，取10個100倍視野，計(jì)數(shù)，取平均值。每組設(shè)5個平行試驗(yàn)。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0進(jìn)行分析處理，6組間PTEN mRNA相對表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率、集落形成數(shù)和穿透細(xì)胞數(shù)的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1靶向PTEN基因siRNA載體構(gòu)建結(jié)果siRNA退火產(chǎn)物與載體重組轉(zhuǎn)化后均得到大量轉(zhuǎn)化菌，對重組質(zhì)粒中插入序列進(jìn)行測序，結(jié)果與所設(shè)計(jì)的發(fā)卡樣單鏈DNA序列一致，見圖1。重組靶向PTEN基因siRNA載體pRNAT-U6.1-si1 311和pRNAT-U6.1-si1 412構(gòu)建成功。

圖1 pRNAT-U6.1-si1 311和pRNAT-U6.1-si1 412插入序列分析結(jié)果

2.2PTEN真核表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果重組載體經(jīng)雙酶切鑒定，得到2個片段，即1 212 bp的PTEN目的基因片段和約5 400 bp的表達(dá)載體pcDNA3.1片段，酶切鑒定與預(yù)期相符(圖2)。對重組質(zhì)粒中目的基因進(jìn)行測序，結(jié)果與所設(shè)計(jì)一致。

2.3各組細(xì)胞PTENmRNA的表達(dá)見表1。

2.4各組細(xì)胞PTEN蛋白的表達(dá)未轉(zhuǎn)染組、siRNA載體對照組、表達(dá)載體對照組在55 000處均有一較弱的PTEN免疫印跡出現(xiàn)；PTEN表達(dá)組細(xì)胞在55 000處有深染的免疫印跡；沉默1組、沉默2組在55 000處有極弱、幾乎不可見的免疫印跡(圖3)。

2.5細(xì)胞增殖檢測結(jié)果見圖4。未轉(zhuǎn)染組、siRNA載體對照組、表達(dá)載體對照組、沉默1組和沉默2組細(xì)胞生長曲線走勢相似，而PTEN表達(dá)組較其他各組減低。

圖2 重組載體pcDNA3.1-PTEN雙酶切鑒定結(jié)果

M：Marker；1：pcDNA3.1雙酶切；2：pcDNA3.1-PTEN雙酶切。

表1 各組細(xì)胞PTEN mRNA相對表達(dá)量比較

F=25.762，P<0.001；*與未轉(zhuǎn)染組比較，P<0.05。

圖3 各組細(xì)胞PTEN免疫印跡結(jié)果

1：沉默1組；2：沉默2組；3：siRNA載體對照組；4：PTEN表達(dá)組；5：表達(dá)載體對照組；6：未轉(zhuǎn)染組。

圖4 各組細(xì)胞生長曲線

2.6細(xì)胞凋亡、軟瓊脂克隆和Transwell試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞凋亡率、克隆形成數(shù)、穿透細(xì)胞數(shù)比較

*與未轉(zhuǎn)染組比較，P<0.05。

3 討論

PTEN的抑癌機(jī)制與其基因結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。PTEN基因包含3個功能區(qū)：①氨基端磷酸酶區(qū)域，可通過去磷酸化作用調(diào)節(jié)磷脂酰3，4，5-三磷酸肌醇(PIP3)水平而影響PIP3-AKT/PKB 凋亡信號途徑，發(fā)揮抑癌作用[8]。②特異性蛋白磷酸酶功能，通過抑制整合素下游分子黏著斑激酶(focaladhesion kinase，F(xiàn)AK)及FAK下游分子P130cas的酪氨酸磷酸化，從而抑制FAK介導(dǎo)的細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移及生長，抑制癌細(xì)胞遷移、擴(kuò)散和黏附。③PTEN過表達(dá)，使細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)磷酸化水平明顯下降，通過抑制MAPK中ERK、MEK、Ras等的活化而抑制MAPK途徑，也就抑制了c-ras和v-mos依賴的細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)化[9-10]。

PTEN作為腫瘤抑制基因在不同的腫瘤中扮演不同的角色。在一些腫瘤組織中，如惡性膠質(zhì)瘤，目前70%出現(xiàn)10q染色體缺失[11-13]，PTEN的雜合性缺失突變除去了等位基因和其自身的表達(dá)。這種情形符合國外學(xué)者[14]對腫瘤抑制基因的假設(shè)，即完整的基因消除在腫瘤生長過程中是必需的。一個等位基因的突變使轉(zhuǎn)錄受到抑制，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中低于普通水平的PTEN表達(dá)。不同水平的PTEN與腫瘤形成呈負(fù)關(guān)聯(lián)以及Akt的活化已在小鼠PTEN亞效等位和超效等位基因?qū)嶒?yàn)中得到證明[15]。事實(shí)表明PTEN水平很小的一點(diǎn)降低也會引起腫瘤細(xì)胞的生長，而這種下降越多則腫瘤細(xì)胞的生長越迅速。

該實(shí)驗(yàn)證實(shí)增加食管癌EC9706細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平，可以有效抑制細(xì)胞的增殖、克隆形成和侵襲轉(zhuǎn)移能力，同時促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

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