袁 園，林 中，李小玲

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 桂林 541001

急性胰腺炎是多種病因?qū)е乱让冈谝认賰?nèi)被激活后，引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎癥反應(yīng)，而重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)患者常伴胃腸動(dòng)力障礙，目前，SAP引起胃腸動(dòng)力障礙的神經(jīng)機(jī)制尚不明確。研究[1-3]表明一氧化氮合酶(nitric oxide sythase,NOS)表達(dá)的改變與多種伴有胃腸動(dòng)力障礙的疾病有關(guān)，而使用NOS抑制劑能在一定程度上改善胃腸道運(yùn)動(dòng)功能。胃腸道的神經(jīng)調(diào)節(jié)與腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)密切相關(guān)。ENS主要由腸肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢組成。研究[4]發(fā)現(xiàn)ENS神經(jīng)元在微環(huán)境改變下能發(fā)生重塑，而該特性又是眾多病理生理過程發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)和前提。研究[5]發(fā)現(xiàn)伴有胃腸動(dòng)力障礙的SAP大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)節(jié)NOS陽性神經(jīng)元比例上調(diào)，推測與胃腸動(dòng)力障礙有關(guān)，而同一部位黏膜下神經(jīng)節(jié)NOS表達(dá)是否改變尚未明確。作者利用機(jī)能實(shí)驗(yàn)觀察SAP模型大鼠結(jié)腸蠕動(dòng)頻率、胰腺病理表現(xiàn)，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察大鼠結(jié)腸黏膜下神經(jīng)節(jié)NOS陽性神經(jīng)元的改變，探討其與SAP胃腸動(dòng)力障礙的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料成年SPF級SD健康雌性大鼠，體質(zhì)量200～230 g，由桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。小鼠抗大鼠神經(jīng)蛋白HuC/HuD單克隆抗體(美國Molecular Probes公司)，兔抗鼠NOS多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；牛磺膽酸鈉(美國Sigma公司)；正常山羊封閉血清、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(四川成都孟秦公司)，解剖顯微鏡(蔡司光學(xué)儀器上海國際貿(mào)易有限公司),熒光顯微鏡(日本奧林巴斯儀器公司)。

1.2SAP模型的制備方法采用腸壁穿刺逆行胰膽管注射牛黃膽酸鈉的方法制作SAP大鼠模型。SD大鼠禁食24 h不禁水，乙醚吸入麻醉，無菌下開腹暴露十二指腸，辨認(rèn)胰膽管，用磨鈍4號半頭皮針逆行胰膽管穿刺4～5 mm后，用動(dòng)脈夾夾閉肝門部膽管，固定針頭，泵入50 g/L牛磺膽酸鈉(1 mL/kg，0.1 mL/min)3～5 min后撤針。繼續(xù)夾閉8～10 min，松開動(dòng)脈夾，復(fù)位腸管關(guān)腹，皮下補(bǔ)液(生理鹽水10 mL)，禁食禁水24 h。

1.3實(shí)驗(yàn)分組20只SD健康雌性大鼠采用抽簽法隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，每組10只。模型組按1.2方法制備模型；假手術(shù)組大鼠用乙醚麻醉后開腹，翻動(dòng)十二指腸及胰腺10次后關(guān)腹，術(shù)后皮下補(bǔ)液(生理鹽水10 mL)，禁食禁水24 h。24 h后，各組存活大鼠用烏拉坦麻醉后開腹，觀察大鼠腹腔內(nèi)腹水情況、有無皂化斑及胰腺和腸管的大體改變；取標(biāo)本進(jìn)行觀測。

1.4觀測指標(biāo)

1.4.1 小腸推進(jìn)比測定 存活大鼠灌服臺(tái)盼蘭1.5 mL/只，以幽門為起點(diǎn)測量含臺(tái)盼蘭小腸的長度及小腸全長。小腸推進(jìn)比=(小腸全長-含臺(tái)盼蘭小腸長度)/小腸全長×100%

1.4.2 結(jié)腸蠕動(dòng)頻率測定 取近回盲部1.5 cm結(jié)腸組織立即浸泡于37 ℃的Kreb液中，將腸段一端系在通氣管上，另一端系在張力換能器上，由BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄5 min結(jié)腸蠕動(dòng)頻率。

1.4.3 胰腺病理觀察 取胰頭組織，置于福爾馬林固定24 h后，HE染色，光鏡下觀察。將胰腺組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤、出血、壞死程度分別按0～4 分評分，各參數(shù)分值相加得總分[6]。

1.4.4 糞便含水量 收集各組大鼠24 h糞便，測定濕重后，于65 ℃烤箱中干燥24 h，測定干重。糞便含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.5 結(jié)腸黏膜下組織NOS陽性神經(jīng)元的測定 距回盲部4 cm向遠(yuǎn)端取1～2 cm結(jié)腸放入4 ℃ Kreb液中漂洗干凈，30 min內(nèi)完成結(jié)腸黏膜下神經(jīng)叢全層標(biāo)本的制作。在解剖顯微鏡下，于4 ℃Kreb液環(huán)境中沿腸系膜剪開、平鋪標(biāo)本，將漿膜面朝上，撕去漿肌層；翻轉(zhuǎn)標(biāo)本使黏膜面朝上剔除黏膜組織，暴露黏膜下神經(jīng)叢，將黏膜下神經(jīng)叢全層標(biāo)本適當(dāng)展開固定，置于Stefanini液(體積分?jǐn)?shù)2%甲醛液50 mL、飽和杏仁酸150 mL、磷酸緩沖液定容至1 000 mL)中固定24 h。用PBS漂洗3×10 min，用含TritonX-100、體積分?jǐn)?shù)10%正常山羊封閉血清的PBS室溫(22 ℃) 孵育30～60 min，用抗HuC/HuD(10 mg/L,4 ℃)孵育24 h,用NOS多克隆抗體(1100，4 ℃)孵育24 h，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1100，22 ℃)孵育45 min，TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(1400，22 ℃)孵育45 min。黏膜面向上，鏡下鋪片，甘油封片，干燥后置于熒光顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本至少觀察200個(gè)HuC/HuD陽性神經(jīng)元(綠色)，計(jì)數(shù)其中NOS陽性神經(jīng)元(紅色)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2組小腸推進(jìn)比、結(jié)腸蠕動(dòng)頻率、糞便含水量及胰腺病理評分符合正態(tài)分布，其比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；2組NOS陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)非正態(tài)分布，采用Mann-Whintney非參數(shù)檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組動(dòng)物一般情況24 h后，假手術(shù)組大鼠無死亡，一般狀況良好，開腹后未見胰腺病灶、腹水、胃腸道擴(kuò)張等胰腺炎相關(guān)表現(xiàn)。模型組大鼠死亡2只，開腹后可見胰腺組織出現(xiàn)出血壞死灶，胰頭尤其明顯；胃腸道擴(kuò)張較明顯，結(jié)腸內(nèi)多有糞便殘留并伴有血性腹水。

2.2 2組小腸推進(jìn)比、結(jié)腸蠕動(dòng)頻率、糞便含水量及胰腺病理評分的比較光鏡下假手術(shù)組胰腺小葉結(jié)構(gòu)完整，可見充血水腫，無胰腺壞死病灶，局部可見炎性細(xì)胞浸潤。模型組胰腺小葉排列紊亂，葉間裂增寬，大量炎性滲出，胰腺腺泡細(xì)胞腫脹，壞死區(qū)內(nèi)腺泡結(jié)構(gòu)消失，胞核溶解(圖1)。假手術(shù)組小腸推進(jìn)比、結(jié)腸蠕動(dòng)頻率、糞便含水量均高于模型組，而胰腺病理評分則低于模型組，見表1。

圖1 2組胰腺組織病理表現(xiàn)(HE,×100)

組別n小腸推進(jìn)比/%結(jié)腸蠕動(dòng)頻率/min-1糞便含水量/%胰腺病理評分假手術(shù)組1041.04±4.3613.40±1.3541.56±6.691.20±0.63模型組814.54±2.304.00±0.9312.98±6.5615.75±1.72t15.47716.7488.86923.569P<0.001<0.001<0.001<0.001

2.3 2組結(jié)腸黏膜下NOS陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)的比較熒光顯微鏡下觀察可見(圖2)黏膜下神經(jīng)元呈多態(tài)性，多以神經(jīng)節(jié)形式聚集分布，神經(jīng)細(xì)胞著色，神經(jīng)纖維不著色。而NOS陽性神經(jīng)元胞體和纖維均可著色。假手術(shù)組NOS陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)為(22.49±5.14)%，模型組為(26.36±2.57)%，2組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.955,P=0.055)。

圖2 2組結(jié)腸黏膜下神經(jīng)元免疫熒光結(jié)果(×200)

A：假手術(shù)組黏膜下神經(jīng)元；B：假手術(shù)組黏膜下NOS陽性神經(jīng)元；C：模型組黏膜下神經(jīng)元；D：模型組黏膜下NOS陽性神經(jīng)元。

3 討論

該實(shí)驗(yàn)采用腸壁穿刺逆行胰膽管注射牛黃膽酸鈉的方法制作SAP大鼠模型，用胰腺HE染色驗(yàn)證造模成功與否；并通過小腸推進(jìn)比、機(jī)能實(shí)驗(yàn)等觀察是否伴有胃腸道運(yùn)動(dòng)障礙；應(yīng)用雙重免疫熒光觀察大鼠黏膜下NOS陽性神經(jīng)元的改變。已有研究[7-8]發(fā)現(xiàn)SAP大鼠結(jié)腸肌間NOS陽性神經(jīng)元和黏膜下血管活性腸多肽(VIP)陽性神經(jīng)元較假手術(shù)組增加，推測上述兩種神經(jīng)元重塑與SAP胃腸動(dòng)力障礙有關(guān)。而該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明同一部位黏膜下神經(jīng)叢NOS陽性神經(jīng)元基本不變。

SAP大鼠結(jié)腸黏膜下神經(jīng)叢NOS表達(dá)基本不變，可能與以下幾方面有關(guān)。①NOS的生物學(xué)功效可能與VIP不同。胃腸道黏膜下NOS和VIP都具有舒張血管、抗炎等作用[9-10]，推測兩者雖同為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，但在結(jié)腸黏膜下的生物學(xué)功能側(cè)重點(diǎn)可能不同。②該實(shí)驗(yàn)中取材為蠕動(dòng)部位的結(jié)腸組織，不能排除其他部位黏膜下神經(jīng)叢NOS表達(dá)改變的可能。有學(xué)者報(bào)道[11]SAP大鼠血清及腸道VIP表達(dá)具有雙向性，即SAP大鼠血清及腸組織VIP于術(shù)后1 h后明顯降低，隨后逐漸增加，于術(shù)后12 h超過假手術(shù)組。而該實(shí)驗(yàn)取材于24 h后的SAP大鼠結(jié)腸組織，不能排除NOS陽性神經(jīng)元也有類似特點(diǎn)，該神經(jīng)元可能在24 h之內(nèi)就已經(jīng)發(fā)生了重塑，或者尚未發(fā)生重塑，因錯(cuò)過觀察時(shí)相，所以未能觀察到NOS陽性神經(jīng)元的改變。Zhou等[12]發(fā)現(xiàn)伴有胃腸動(dòng)力障礙的急性壞死性胰腺炎大鼠回腸NOS蛋白表達(dá)下降。故不能排除結(jié)腸黏膜下NOS陽性神經(jīng)元數(shù)目上調(diào)的可能，該上調(diào)效應(yīng)可能因部分表達(dá)下調(diào)的中和而呈現(xiàn)出表達(dá)基本不變的假象。③該研究樣本含量有可能造成一定的偏差。④近幾年來，作為ENS重要組成部分的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對胃腸動(dòng)力的影響日益受到人們的關(guān)注[13]，但在SAP中對各類神經(jīng)元的影響尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

因此，作者認(rèn)為SAP伴有胃腸動(dòng)力障礙是多因素共同作用的結(jié)果，雖然伴有胃腸動(dòng)力障礙SAP大鼠結(jié)腸黏膜下NOS陽性神經(jīng)元未發(fā)生明顯重塑，但ENS在伴有胃腸動(dòng)力障礙SAP中的作用和改變?nèi)杂欣^續(xù)研究的空間及價(jià)值。

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