陽(yáng)麗云 曾漣 莫浪平 韋雄麗

阿片類藥物因其強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛作用，在癌痛的治療中起著 非常重要的作用[1]。目前研究認(rèn)為阿片類藥物除對(duì)癌痛患者具有鎮(zhèn)痛效果以外，對(duì)癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡也產(chǎn)生一定影響[2-4]。阿片類中的代表藥物芬太尼，廣泛用于手術(shù)患者及癌痛患者的鎮(zhèn)痛。國(guó)內(nèi)張咸偉等[5]研究表明，芬太尼抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖且具有時(shí)間和劑量依賴性。其研究中采用未去除雌激素的新生小牛血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Berthois等[6]研究發(fā)現(xiàn)，酚紅、雌激素都會(huì)對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，建議在研究MCF-7細(xì)胞的增殖時(shí)盡量排除這些因素的干擾。所以本實(shí)驗(yàn)擬在去激素新生小牛血清及無(wú)酚紅培養(yǎng)基條件下研究芬太尼對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響。以觀察在不同培養(yǎng)條件下，芬太尼對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的影響是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 MCF-7乳腺癌細(xì)胞由廣西醫(yī)科大學(xué)覃怡師姐惠贈(zèng)。含酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；無(wú)酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Wisent公司；新生小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；活性炭購(gòu)自西隴化工股份有限公司；葡聚糖4萬(wàn)南購(gòu)自京都萊生物技術(shù)有限公司；MTT粉末及二甲基亞砜購(gòu)自Sigma公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自invertrogen公司；芬太尼購(gòu)自宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司；倒置相差顯微鏡為Olympus公司；酶標(biāo)儀為美國(guó)Thermo公司；流式細(xì)胞檢測(cè)儀為Beckman Coulter公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生小牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/ml青霉素的含酚紅的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)傳代，以1：2的比例傳代。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理時(shí)更換為含10%去激素新生小牛血清的無(wú)酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基，去激素新生小牛血清的制備參照考朱毅等[7]文獻(xiàn)中的方法獲得。實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞增殖的檢測(cè) 將細(xì)胞消化離心后，用含10%去激素新生小牛血清的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基重懸。按照3×104/ml的密度接種于96孔板，200 μl/孔。設(shè)置正常對(duì)照組（C組）、芬太尼組（F1組、F2組、F3組、F4組、F5組）和凋零組。24 h后，F(xiàn)1、F2、F3、F4、F5組加入芬太尼，使芬太尼終濃度分別為1、0.1、0.01、0.001、0.0001 μmol/L，C組加入等體積的PBS，凋零組為無(wú)細(xì)胞只加培養(yǎng)基組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在24、48、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，加入MTT（5 mg/ml）20μl，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜200μl，搖床緩慢振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞遷移的檢測(cè) 將細(xì)胞用含10%去激素新生小牛血清的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基重懸，以2×105/ml的密度接種于6孔板內(nèi)，每孔1 ml，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%滿時(shí)，用規(guī)格為200μl的Tip頭對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃痕，用PBS輕輕吹打以去除刮掉的細(xì)胞，設(shè)置C組、F1、F2、F3、F4、F5組，F(xiàn)1、F2、F3、F4、F5組加入芬太尼使芬太尼終濃度分別為1、0.1、0.01、0.001、0.0001 μmol/L，C組為對(duì)照組加入等體積PBS，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別于0、24 h進(jìn)行拍照，采用Image Pro Plus6分析圖像，計(jì)算遷移距離。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 將細(xì)胞用含10%去激素新生小牛血清的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基重懸后，按2×105/ml的密度接種于6孔板內(nèi)，每孔1 ml，24 h后，F(xiàn)1、F2、F3、F4、F5組加入芬太尼使芬太尼終濃度分別為1、0.1、0.01、0.001、0.0001 μmol/L，C組加入等體積的PBS，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用0.25%不含EDTA的胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，收集細(xì)胞，采用Annexin Ⅴ-FITC試劑盒（按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度芬太尼對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 作用MCF-7乳腺癌細(xì)胞24、48、72 h時(shí)，芬太尼組各組OD值與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 芬太尼對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 芬太尼對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖的影響（±s）

*與C組比較，P>0.05

組別 24 h OD值 48 h OD值 72 h OD值C 組 0.998±0.127 1.259±0.197 1.580±0.193 F1 組 1.023±0.150* 1.111±0.079* 1.294±0.310*F2 組 0.957±0.160* 1.230±0.205* 1.492±0.222*F3 組 1.020±0.052* 1.342±0.248* 1.344±0.351*F4 組 0.994±0.085* 1.190±0.297* 1.415±0.237*F5 組 0.943±0.076* 1.313±0.261* 1.434±0.332*

2.2 不同濃度芬太尼對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞遷移的影響 作用MCF-7乳腺癌細(xì)胞24 h時(shí)，C組、F1組、F2組、F3組、F4 組、F5 組遷移距離分別為：（191.95±43.05）μm，（212.96±116.83）μm，（260.43±112.90）μm，（239.54±43.33）μm，（231.10±45.62）μm，（234.81±61.59）μm。芬太尼組各組細(xì)胞遷移距離與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。細(xì)胞劃痕結(jié)果如圖1所示。

2.3 不同濃度芬太尼對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響作用MCF-7乳腺癌細(xì)胞24 h時(shí)，C組、F1組、F2組、F3組、F4組、F5組凋亡率分別為：（31.84±12.85）%，（22.53±8.75）%，（34.02±11.23）%，（26.72±14.18）%，（28.87±5.40）%，（33.23±17.11）%，芬太尼組各組凋亡率與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

乳腺癌為女性常見(jiàn)惡性腫瘤，與女性健康密切相關(guān)。乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡與乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此一直是研究的熱點(diǎn)。石利濤等[8]從治療藥物的角度，研究發(fā)現(xiàn)干擾素-γ、干擾素-α2b的聯(lián)合應(yīng)用可誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)擬從癌痛鎮(zhèn)痛的角度，研究常用鎮(zhèn)痛藥物芬太尼對(duì)雌激素受體陽(yáng)性的MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響，為臨床研究奠定基礎(chǔ)。

圖1 芬太尼對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞遷移的影響 （劃痕實(shí)驗(yàn)，×40倍）

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在含去激素新生小牛血清的無(wú)酚紅培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，芬太尼對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡無(wú)明顯影響。張咸偉等[5]研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼濃度大于0.1 μmol/L時(shí)，MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖活性明顯下降。趙海燕等[9]研究認(rèn)為，芬太尼抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞侵襲。丁漢琳等[10]研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼大于5 μmol/L時(shí)，MCF-7凋亡細(xì)胞明顯增加。本實(shí)驗(yàn)與以上研究結(jié)論產(chǎn)生差別的主要原因考慮為培養(yǎng)條件不一致導(dǎo)致的。本實(shí)驗(yàn)采用的是去激素新生小牛血清和無(wú)酚紅培養(yǎng)基，張咸偉、趙海燕等采用的是未去除激素的新生小牛血清。Berthois等[6]研究發(fā)現(xiàn)，酚紅、雌激素會(huì)對(duì)雌激素受體陽(yáng)性的MCF-7細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，建議在研究MCF-7細(xì)胞的增殖時(shí)盡量排除這些因素的干擾。因此本實(shí)驗(yàn)采用去激素新生小牛血清和無(wú)酚紅培養(yǎng)基，擬盡量減少干擾因素的影響，研究芬太尼對(duì)MCF-7細(xì)胞的直接作用。Maneckjee等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在含激素新生小牛血清中，嗎啡具有抑制MCF-7細(xì)胞增殖的作用，但在去除了新生小牛血清中的激素后，嗎啡并不表現(xiàn)出抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖的作用。并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)添加17β-雌二醇可以增加嗎啡對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)。但是雌激素通過(guò)何種途徑影響MCF-7乳腺癌細(xì)胞對(duì)嗎啡的敏感性的機(jī)制待于進(jìn)一步研究[11]。張咸偉、丁漢琳等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，μ受體拮抗劑納洛酮并不能拮抗芬太尼對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制增殖作用和促凋亡作用[5，10]。

因此，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張咸偉等實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較，推測(cè)芬太尼可能不是直接作用于MCF-7乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制效應(yīng)，而是有可能通過(guò)影響培養(yǎng)基中雌激素類物質(zhì)與MCF-7乳腺癌細(xì)胞表面雌激素受體的作用而產(chǎn)生抑制效應(yīng)，也有可能是雌激素影響MCF-7乳腺癌細(xì)胞對(duì)芬太尼的敏感性，這些推測(cè)有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

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