陳 芬

（武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430074）

葡萄糖酸鈉又稱五羥基己酸鈉, 是一種白色或淡黃色結(jié)晶粉末, 易溶于水, 微溶于醇, 不溶于醚。其分子式為C6H11O7Na, 相對分子質(zhì)量為218. 14[1]。葡萄糖酸鈉是合成葡萄糖酸鹽的中間體，同時自身具有優(yōu)良的螯合作用，在食品工業(yè)可用作食品添加劑、營養(yǎng)增補(bǔ)劑、食品保鮮劑、品質(zhì)改良劑等[2]，也可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工和建筑等方面，葡萄糖酸鈉市場潛力巨大。

目前葡萄糖酸鈉的生產(chǎn)方法主要有生物發(fā)酵法、催化氧化法和電解氧化法[2-4]等。生物發(fā)酵法[5-7]逐漸成為主要的葡萄糖酸鈉生產(chǎn)方法。該方法是利用葡萄糖經(jīng)過黑曲霉產(chǎn)的葡萄糖氧化酶簡單的脫氫作用而得到葡萄糖酸內(nèi)酯和雙氧水，再經(jīng)過進(jìn)一步水解為葡萄糖酸，雙氧水經(jīng)過水解作用轉(zhuǎn)化為水和氧，同時添加一定量的氫氧化鈉溶液保持一定的pH值而得到葡萄糖酸鈉，若用碳酸鈣來調(diào)節(jié)pH，則產(chǎn)物的形式為葡萄糖酸鈣。在黑曲霉發(fā)酵葡萄糖過程中，發(fā)酵條件影響葡萄糖酸鈉的得率。本研究通過工藝優(yōu)化，創(chuàng)造適合菌體生長和生物代謝的最佳條件，充分發(fā)揮菌種的生產(chǎn)潛力，從而顯著提高發(fā)酵產(chǎn)量，為黑曲霉發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)葡萄糖酸鈉提供相應(yīng)的工藝參數(shù)，以期進(jìn)一步提高生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 葡萄糖：上海秉奇化工科技有限公司生產(chǎn)。營養(yǎng)瓊脂

1.1.2 菌種 從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)購得的黑曲霉菌種2089。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖8g/L，酵母膏2g/L，蛋白胨2g/L，MgS040.2g/L，NaH2P040.1g/L，KH2P040.1g/L MnS040.01g/L，瓊脂1.5g/L。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，MgS04，0.02 g/L，NaH2P040.1 g/L，KH2P040.1 g/L，MnS04100.01 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100g/L，MgS040.03 g/L，KH2P040.29/L，(NH4)2HP04，0.9g/L，MnS040.06g/L，CaC0326g/L。滅菌后接入菌種，振蕩培養(yǎng)。

1.1.4 儀器

恒溫調(diào)速搖床、pH計(jì)、電爐、電熱培養(yǎng)箱、無菌操作臺、電子天平、722s型分光光度計(jì)。

1.1.5 試劑

葡萄糖酸鈉、硫酸銅、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、碳酸鈣、氫氧化鈉。試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：將保藏管中的菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，28℃，培養(yǎng)72小時。

種子培養(yǎng)：取新鮮的斜面活化菌種，在無菌操作臺上用接種環(huán)刮下菌體接種于裝有100mL 種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，培養(yǎng)24小時，搖床220r/min，30℃。

發(fā)酵培養(yǎng)：將一定量種子液接種到裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，用不同的培養(yǎng)24小時，搖床220r/min，30℃。

1.2.2 葡萄糖濃度的測定方法——用DNS法

DNS試劑的配制：將6.3 g 3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶于少量熱蒸餾水中，加入2mol/L NaOH溶液262mL,加入192g酒石酸鉀鈉, 5.0g亞硫酸鈉，加熱攪拌溶解，冷卻后定容至1000mL容量瓶中，保存于棕色瓶中，一周后使用。

配制1.0mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.00mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于6支25mL的具塞試管中，分別加入DNS試劑2.0mL，于沸水浴中加熱2min進(jìn)行顯色，取出后用流水迅速冷卻，各加入蒸餾水9.0mL，搖勻，在540nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 發(fā)酵過程中葡萄糖酸鈉的測定——用分光光度法

配制0.1mol／L葡萄糖酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.1mol/L硫酸銅溶液。

葡萄糖酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別取0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10mL葡萄糖酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液于11支50mL的具塞試管中，分別加入10mL硫酸銅溶液，蒸餾水定容，沸水中加熱3分鐘，取出用自來水沖洗試管外部使其迅速冷卻至室溫，722s型分光光度計(jì)在700nm波長下，以不加葡萄糖酸鈉的溶液作空白，測其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 菌體量的測定方法

取100mL培養(yǎng)液，過濾，用蒸餾水洗至中性，在80℃下烘干8小時至恒重，冷卻至室溫測定其質(zhì)量。

1.2.5 黑曲霉發(fā)酵葡萄糖條件的優(yōu)化

發(fā)酵條件的優(yōu)化是改變培養(yǎng)基的組成、改變接種量及發(fā)酵時間、在發(fā)酵過程中改變培養(yǎng)溫度、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、調(diào)節(jié)pH等措施，從而強(qiáng)化微生物的生物合成的全過程，提高發(fā)酵產(chǎn)量。通過工藝條件優(yōu)化，創(chuàng)造適合菌體生長和生物代謝的最佳條件，充分發(fā)揮菌種的生產(chǎn)潛力，從而顯著提高發(fā)酵產(chǎn)量。

在實(shí)際的生產(chǎn)中，影響黑曲霉發(fā)酵的主要因素有葡萄糖濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量、充氧量和pH等。

本實(shí)驗(yàn)選擇了影響微生物發(fā)酵的三個主要因素：發(fā)酵時間、溫度、和黑曲霉的接種量。分別測定20小時內(nèi)發(fā)酵液中殘?zhí)橇颗c菌體濃度，確定三個因素對發(fā)酵的影響，得到最佳優(yōu)化工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖的起始濃度對菌體發(fā)酵的影響

通過考察葡萄糖的起始濃度分別為60g/L、80g/L、100 g/L、120g/L，發(fā)酵20h時，測定葡萄糖酸鈉的產(chǎn)量，結(jié)果如圖1。

圖1 葡萄糖不同初始濃度對產(chǎn)葡萄酸鈉的影響

圖2 pH值對葡萄糖酸鈉含量的影響

從圖1可以看出，葡萄糖最佳起始濃度為100g／L左右，在這種條件下，葡萄糖酸鈉的產(chǎn)量可達(dá)到85g/L以上。

在整個發(fā)酵過程中，葡萄糖一部分被用于菌體生長和維持等生理代謝過程，另一部分則被菌體代謝過程中產(chǎn)生的葡萄糖氧化酶催化生成預(yù)期產(chǎn)物。由于葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸的過程需要氧氣的參與，因而決定了氧氣在黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸工藝過程的中心地位。黑曲霉發(fā)酵對葡萄糖濃度度要求高，當(dāng)葡萄糖濃度較低時，發(fā)酵液中的溶氧水平較高，反應(yīng)速度較快，但葡萄糖濃度太低，生產(chǎn)量小。而當(dāng)葡萄糖濃度增加時，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，蛋白質(zhì)的濃度降低，當(dāng)發(fā)酵液中有Ca2+時，生成的鈣鹽就會結(jié)晶析出，將導(dǎo)致系統(tǒng)溶氧的降低而使黒曲霉產(chǎn)酶速度變慢甚至停滯。

2.2 pH對菌體發(fā)酵的影響

微生物的生長及產(chǎn)物的形成必須進(jìn)行多種多樣的酶催化反應(yīng)，pH的變化會引起各種酶活力的改變，對菌體形態(tài)和代謝途徑影響很大。黑曲霉可產(chǎn)生多種弱有機(jī)酸，如檸檬酸，葡萄糖酸，草酸等，這些有機(jī)酸的生產(chǎn)取決于反應(yīng)液的pH。當(dāng)pH低于3.5時可推動TCA循環(huán)，從而產(chǎn)生檸檬酸，葡萄糖酸鈉的產(chǎn)量很低。pH在4.5到8時，可產(chǎn)生葡萄糖酸。本實(shí)驗(yàn)控制pH值從3-9，分別發(fā)酵20h, 觀察葡萄酸鈉的產(chǎn)量，結(jié)果如圖2，將發(fā)酵液的pH值控制在7左右，產(chǎn)量最大，在實(shí)驗(yàn)中通常是通過在發(fā)酵液中加入一定量的CaC03以維持黑曲霉生長發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH值的穩(wěn)定，防止由于黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸使發(fā)酵液中pH值過低而得到檸檬酸等有機(jī)酸而降低生產(chǎn)效率。

2.3 發(fā)酵時間對菌體發(fā)酵的影響

通過測定發(fā)酵液中菌體含量隨時間的變化趨勢證明當(dāng)發(fā)酵到20h時，發(fā)酵液中的菌體含量達(dá)到最高值，在發(fā)酵后階段，黑曲霉開始衰亡，產(chǎn)酶能力下降，酶活力也隨之逐漸降低，菌體的含量基本保持平衡。

對發(fā)酵液每隔2小時測菌體量的變化情況，繪制菌體生長曲線，如圖3所示。

從圖3可以看出，黑曲霉菌體在從種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)液的最初2小時中，逐漸適應(yīng)周圍的生長環(huán)境，2小時后進(jìn)入對數(shù)生長期，菌體量迅速增加，直到l2小時后質(zhì)量增長變緩，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，15小時后菌體質(zhì)量變化不大，此時發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)基本全部消耗掉，產(chǎn)酶量達(dá)最大。在發(fā)酵后階段，黑曲霉開始衰亡，產(chǎn)酶能力下降，酶活力也隨之逐漸降低。

從圖4也可以看出黑曲霉在發(fā)酵開始階段為黑曲霉生長階段，此時菌體量增加較快，葡萄糖含量逐步下降，此時所產(chǎn)葡萄糖酸鈉增量較小，黑曲霉經(jīng)過一段時間產(chǎn)酸量增加，葡萄糖含量下降速度較快，此時菌體量變化不大，用CaCO3控制發(fā)酵液的pH值為7，并不斷攪拌，葡莓糖酸鈉產(chǎn)量增加較快，發(fā)酵至20h，發(fā)酵液中葡萄糖基本消耗，含量不足2%班，葡萄糖酸鈉的濃度基本保持平衡，此時可認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。

2.4 溫度對菌體生長的影響

微生物的生長和產(chǎn)物的合成都是在各種酶的催化下進(jìn)行的，溫度是保持酶活性的最重要條件，從酶促反應(yīng)動力學(xué)來看，溫度升高，酶促反應(yīng)速度加快，生長繁殖快，但溫度越高，酶失活越快，菌體易于衰老，影響產(chǎn)物生成。溫度還影響營養(yǎng)物和氧在發(fā)酵液中的溶解、菌體生物合成方向以及菌體的代謝調(diào)節(jié)。在最適溫度下，菌種可以獲得最佳的生長代謝效果，往往各種代謝途徑也比較旺盛。因此確定菌體發(fā)酵最適溫度對產(chǎn)酸量的影響至關(guān)重要。改變搖床溫度，黑曲霉在不同培養(yǎng)溫度下對發(fā)酵終結(jié)發(fā)酵液中殘?zhí)橇康挠绊懬闆r如圖5所示。

從圖5和圖6看出，從發(fā)酵液中葡萄糖的消耗速度和黑曲霉的菌體量隨溫度的升高而增加，溫度低于30℃時發(fā)酵終結(jié)發(fā)酵液中存在一定濃度的葡萄糖，反應(yīng)不完全，黑曲霉所產(chǎn)酶活力降低，搖床溫度為30℃時，黑曲霉生長情況最好，因而最佳發(fā)酵溫度為30℃。

2.5 接種量對菌體發(fā)酵的影響

圖7 接種量對殘?zhí)橇康挠绊?/p>

圖8 接種量對菌體量的影響

接種量對黑曲霉發(fā)酵過程中有很重要的影響，接種量低會延長發(fā)酵時間，降低生產(chǎn)效率，太高會過多消耗發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)和葡萄糖，降低產(chǎn)量。因此，采用發(fā)酵培養(yǎng)基，考察了8%、10%、12%、14%不同接種量下菌體發(fā)酵情況，分別測定了接種量對發(fā)酵終結(jié)殘?zhí)橇亢途w量的影響。

從圖7和圖8可以看出，接種量在8%時，發(fā)酵終結(jié)發(fā)酵液中有很高的殘?zhí)橇浚揖w量較小，接種量在10%以上時，發(fā)酵液中葡萄糖全部消耗，接種量高于10%時，雖然葡萄糖全部消耗，但有一部分作為黑曲霉?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)被消耗，接種量過高，發(fā)酵液中過高的菌體量反而阻止了黑曲霉的進(jìn)一步生長發(fā)酵。采用較大的接種量可以縮短菌體繁殖達(dá)到高峰的時間。但如果接種量過多，營養(yǎng)物質(zhì)迅速消耗，菌體早衰，造成發(fā)酵后勁不足，從而使產(chǎn)酶量降低。而接種量過小，延長發(fā)酵周期，同時菌體的生長與產(chǎn)酶均受顯著影響，

2.6 最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件的確定

通過上述實(shí)驗(yàn)，最后確認(rèn)黑曲霉發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)葡萄糖酸鈉的最佳發(fā)酵條件葡萄糖初始濃度為100g/L，pH7，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為20h，接種量10%，在此條件下發(fā)酵液葡萄糖酸鈉的含量可達(dá)85g/L以上，產(chǎn)量比其它方法都高[3]。

3 結(jié)論

葡萄糖酸鈉已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、建筑及化工等領(lǐng)域，近年來，隨著其用途的不斷開發(fā)，葡萄糖酸鈉產(chǎn)量和需求量也不斷增加。通過黑曲霉發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)葡萄糖酸鈉逐漸成為葡萄糖酸鈉生產(chǎn)的主要方法。

通過本試驗(yàn)探究，確定了黑曲霉發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)葡萄糖酸鈉的最佳發(fā)酵條件，此條件下黑曲霉產(chǎn)葡萄糖酸鈉量最高。為黑曲霉發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)葡萄酸鈉提供了相應(yīng)的工藝參數(shù)，有利于提高葡萄糖酸鈉的得率。也為進(jìn)一步在發(fā)酵罐中黑曲霉發(fā)酵大量生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的研究提供參考。

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