黃 俊，李家園，朱 祎，張清順，侯建軍*

（1. 污染物分析與資源化技術(shù)湖北省重點實驗室 (湖北師范學(xué)院)，湖北 黃石 435002；2. 湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002 )

0 前言

六氯苯(HCB)是一類典型的持久性有機污染物(POPs)，能在環(huán)境中持久殘留，不易降解；能通過食物鏈的富集作用對生物造成嚴重影響；也能夠經(jīng)過長距離遷移到達遠離污染源的地區(qū)，對接觸該物質(zhì)的生物造成損害[[1,2]。六氯苯在12種POPs中屬于較易揮發(fā)的農(nóng)藥，所以在合成和使用過程中，一定量的HCB能夠進入環(huán)境并存留于水體、大氣、土壤和沉積物中[3,4]，對魚類和底棲生物產(chǎn)生較大威脅。目前，關(guān)于重金屬對水生生物生態(tài)毒理效應(yīng)的研究報道較多[5-7]，而關(guān)于有機物尤其是HCB對水生生物的影響研究相對較少。HCB毒性作用的主要靶器官是動物的肝臟[8]，鰓是直接暴露于水體的組織，其生理變化對HCB的脅迫較為靈敏[9]。HCB在體內(nèi)代謝時，可產(chǎn)生多種中間代謝產(chǎn)物，并伴隨產(chǎn)生大量的活性氧自由基(如O2-，·OH)[10]。人們在研究污染物的致毒機理中，發(fā)現(xiàn)污染物暴露過程中，機體在產(chǎn)生活性氧的同時，能誘導(dǎo)體內(nèi)相應(yīng)的抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)揮作用，而抗氧化防御系統(tǒng)的酶活性或含量也會隨著污染物的脅迫而發(fā)生相應(yīng)改變，如SOD，CAT，GST，GSH等均可被誘導(dǎo)，從而使機體免受氧化傷害[11]。因而，這些生物標志物的活性變化能間接反映環(huán)境中氧化應(yīng)激的存在，可作為環(huán)境污染脅迫的指標[12]。如 Peters等[13]據(jù)此認定可以將抗氧化酶活性作為指示污染引起氧化脅迫的生物標志物。

梨形環(huán)棱螺在我國分布廣泛，多生活在河流、池塘、湖泊等水體，是大型底棲生物的重要組成部分，在水生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用，它們很容易捕獲和在室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖，對污染物敏感性高[14]。本研究選用梨形環(huán)棱螺作為實驗材料，通過暴露實驗方法研究不同濃度 HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓組織抗氧化指標(SOD、CAT、GST、GSH)的變化情況，初步探討HCB對梨形環(huán)棱螺的的氧化脅迫及防御作用機理，為水環(huán)境POPs污染的早期診斷及生態(tài)風(fēng)險評價提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

梨形環(huán)棱螺(Bellamya purificata)采自于湖北省黃石市磁湖，質(zhì)量2±0.2g。實驗前選擇健康的環(huán)棱螺放在水箱中適應(yīng)和馴養(yǎng)一個星期。馴養(yǎng)期間，實驗用水為曝氣 3d 的自來水，每日換水一次，其它飼養(yǎng)環(huán)境條件是：pH 6.4，飼養(yǎng)溫度20~25 ℃；急性毒理實驗前1天停止喂食，實驗期間不喂食[15]。

1.2 儀器試劑

1.2.1 實驗儀器

相關(guān)儀器設(shè)備需要：紫外可見分光光度計（美國Thermo公司），高速冷凍離心機(德國Eppendorf，5430R)，DIAX900微量勻漿機(德國Heidolph公司)等，HP300G-C型智能光照培養(yǎng)箱（瑞華儀器），雷磁PHS-25（上海精科）。

1.2.2 實驗試劑

六氯苯(HCB)、NBT、EDTA 、L-Met 、磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、NaOH固體、95%乙醇、85%磷酸、Brillisnt Blue G250、30%H2O2、DTNB、三氯乙酸（以上試劑購自國藥集團化學(xué)試劑公司），維生素C、硫代巴比妥鈉、二甲基亞砜(DMSO)（上述藥品均購自Sigma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 HCB在體毒物毒性暴露實驗

急性毒性試驗方法和在體毒性暴露試驗采取我們實驗室已經(jīng)建立和使用的方法[15]。

1.3.2 酶樣的制備

酶樣制備方法和相關(guān)程序采用本實驗室已經(jīng)建立和優(yōu)化的方法[15]。

1.3.3 抗氧化酶活性的測定

SOD活性的測定采用NBT法[16]，酶活力單位定義為：每mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為1個活性單位(U)。CAT活性的測定采用紫外分光光度法[17]，酶活力單位定義為：每mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中每分鐘分解1μmol的H2O2的量為1個活性單位(U)。GST活性的測定采用CDNB法[18]，酶活力單位定義為：在25 ℃，pH 6.5，基質(zhì)CDNB與GSH終濃度均為1 mmol/L的條件下，1分鐘催化1 μmol/L CDNB與GSH結(jié)合的GST酶量為1U。

1.3.4 GSH的測定

GSH采用DTNB法測定[19]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理方法

試驗結(jié)果采用平均數(shù)±標準誤（Means ±SD）表示，全部試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 16. 0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。各組間的顯著性檢驗采用單因素方差分析，采用LSD法進行對照組與各劑量組的兩兩比較，抗氧化指標間的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，差異顯著用P<0.05表示，差異極顯著用P<0.01表示。繪圖軟件采用Orgin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓SOD活性的影響

由圖1A可知，各劑量組肝臟中SOD的活性在暴露的第1d 被誘導(dǎo)升高，8.0、16.0劑量組的酶升高了33%，2.0、4.0劑量組的酶活性升高了11%～16%（p<0.05）；隨后各劑量組SOD活性呈劑量依賴性回落，直至達到各自的最低值，此時，16.0與對照組相比下降了40%（p<0.01）；隨后除2.0劑量組保持緩慢上升趨勢直到實驗結(jié)束外，其余劑量組SOD活性均經(jīng)歷一個先上升后下降的過程；到第14天時，與對照組相比，2.0、4.0劑量組SOD活性約上升了5.6%（p>0.05），而16.0劑量組約下降了39%（p<0.01），已受到極顯著抑制，并且各劑量組的活性與其劑量呈負相關(guān)。

圖1B顯示，各劑量組鰓組織中SOD活性在暴露起始時均被顯著誘導(dǎo)升高，直至達到各自峰值，此時與對照組相比，2.0、8.0劑量組SOD活性上升了173%，4.0、16.0劑量組上升了100%左右（p<0.01）；隨后各劑量組SOD活性開始下降，其中2.0劑量組一直下降，至第7d時已降至對照組附近，并維持這一水平；16.0劑量組與對照組相比下降了32%后，處于抑制狀態(tài)，而8.0劑量組仍處于誘導(dǎo)狀態(tài)。隨著暴露時間延長，各劑量組均呈現(xiàn)先上升后下降的波動變化；到第14d時，與對照組相比，16.0劑量組SOD下降了32%，處于顯著抑制狀態(tài)（p<0.05），4.0與8.0劑量組SOD活性雖分別上升了23.8%和43.5%，仍處于誘導(dǎo)狀態(tài)。

圖1 HCB 對梨形環(huán)棱螺肝臟（A）和鰓（B）中SOD 活性的影響

2.2 不同濃度HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓組織CAT活性的影響

在圖2A中，肝臟各劑量組CAT在HCB暴露起始時，活性就被誘導(dǎo)升高，其中8.0劑量組升高率為45%（p<0.05），其他劑量組則上升了 15%左右； 除了 4.0劑量組的活性維持穩(wěn)定直到實驗結(jié)束，而其他劑量組均下降到對照組附近，但仍處于誘導(dǎo)狀態(tài)（p＞0.05）；從第2d開始，各劑量組CAT活性均被持續(xù)誘導(dǎo)升高，低劑量組（2.0mg/L）上升到了對照組的230%，其他則上升了67%（p<0.01）；之后，各劑量組CAT活性又急劇下降，到第14天時，2.0劑量組CAT活性為對照組的140%（p<0.01）；與對照組相比，8.0、16.0劑量組活性下降了11%，略低于對照組，最終表現(xiàn)出低濃度誘導(dǎo)，高濃度抑制的現(xiàn)象。

圖2B顯示，鰓組織CAT在HCB暴露后活性被誘導(dǎo)升高，其中2.0和4.0劑量組上升幅度較大，4.0劑量組的CAT活性上升到了對照組的300%（p<0.01）；然后活性開始下降，到第14天時，2.0劑量組的CAT活性為對照組的 125%（p<0.05），4.0劑量組為對照組的 167%（p<0.01）。8.0和16.0約上升了62%（p<0.05），之后又回落至對照組附近，但此時8.0劑量組酶活性略高于對照組，而16.0劑量組酶活性略低于對照組（p>0.05）。從第2d開始，這兩組酶的活性被持續(xù)誘導(dǎo)升高，達到峰值時，16.0劑量組CAT升高了80%，而8.0劑量組活性則上升到了對照組的260%（p<0.01）；之后其活性急劇下降，至第14d時，8.0劑量組與對照組活性相當，而16.0劑量組與對照組相比，其活性下降了16%，已受到了輕微抑制（p>0.05）。

圖2 HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟（A）和鰓（B）中CAT 活性的影響

2.3 不同濃度HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓組織GST活性的影響

從圖3A可見，各劑量組肝臟中GST在暴露的第1d內(nèi)活性就被誘導(dǎo)上升，較對照組升高了15%～30%；之后各劑量組GST活性又回落到對照組附近（p＞0.05）；隨后GST活性又被持續(xù)誘導(dǎo)升高，直至達到各自的峰值，此時2.0劑量組GST活性升到了對照組的250%，4.0、16.0升到了對照組的200%，8.0升到了對照組的160%（p<0.01）。然后GST活性持續(xù)下降至第10天，在第10-14d其活性維持穩(wěn)定，其中2.0、4.0劑量組仍處于誘導(dǎo)狀態(tài)，而8.0和16.0劑量組則處于抑制狀態(tài)，其中4.0劑量組的GST活性較對照組上升了25%（p<0.05）。

在圖3B中，各劑量組鰓組織中的GST在暴露的第1d內(nèi)，其活性被誘導(dǎo)輕微上升（其中最高僅上升了2.5%），然后開始回落，第2d時，2.0和4.0劑量組略高于對照組，而8.0和16.0劑量組低于對照組（p>0.05）；隨后GST活性均被誘導(dǎo)上升到較高水平。此時，與對照組相比，2.0、4.0劑量組GST活性上升了175%左右，8.0、16.0劑量組上升了150%左右（p<0.01）；隨后GST活性急劇下降；到第14d時，中低劑量組的GST活性約為對照組的175%，仍處于顯著被誘導(dǎo)狀態(tài)（p<0.05），高劑量組（16.0 mg/L）與對照組相比約下降了15%，已受到輕微抑制。

圖3 HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟（A）和鰓（B）中GST 活性的影響

2.4 不同濃度HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓中GSH含量的影響

在圖4A中，在暴露的第1d內(nèi)，肝臟各劑量組的GSH均被誘導(dǎo)而緩慢上升，上升約25%后略有下降，至第2d時僅略高于對照組（p>0.05），然后GSH被顯著誘導(dǎo)升高，直至達到各自的峰值，并且其峰值與各自的劑量呈正相關(guān)。此時與對照組相比，高劑量組（16.0 mg/L）約上升了180%，低劑量組（2.0 mg/L）約上升了120%（p<0.01）。隨后各劑量組的GSH含量均持續(xù)下降，并且其下降的幅度同樣與各劑量呈正相關(guān)，低劑量組（2.0 mg/L）GSH含量僅僅有輕微回落，其他劑量組下降明顯；到第14d時，0.2劑量組僅下降了10%，含量仍極顯著高于對照組（p<0.01）；4.0劑量組約下降了58%，含量仍顯著高于對照組（p<0.05）；而8.0劑量組已下降至對照組附近，與對照組相比差異不顯著（p>0.05）；16.0劑量組的GSH含量已降至對照組以下，約下降了360%，其含量已被顯著抑制（p<0.05）。

圖4 HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟（A）和鰓中GSH（B）活性的影響

鰓組織GSH變化規(guī)律與肝臟相似（圖4B）。各劑量組鰓組織GSH在暴露的第1d內(nèi)均被誘導(dǎo)升高，含量均上升了200%-250%（p<0.01）；除2.0和8.0劑量組在第2d稍經(jīng)回落并再度持續(xù)上升外，其他各劑量組均保持上升趨勢，直至達到各自的峰值。其中，16.0劑量組最早達到峰值。此時，與對照組相比，高劑量組（16.0 mg/L）約上升了300%，中劑量組（4.0、8.0 mg/L）約上升了325%，低劑量組（2.0 mg/L）約上升了250%，其含量均極顯著高于對照組（p<0.01）。隨后，各劑量組GSH含量開始下降，并且其下降幅度與各劑量呈正相關(guān)，到第 14d時中低劑量組已下降至對照組的 175%－250%，但仍極顯著高于對照組（p<0.01）；16.0劑量組約下降了400%，并已降至對照組以下，其GSH含量已被抑制（p>0.05）。

3 討論及結(jié)論

3.1 HCB對梨形環(huán)棱螺SOD活性的影響

進入生物體的 HCB能產(chǎn)生過多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，而廣泛存在于螺組織細胞內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)可將超氧陰離子自由基歧化成H2O2和O2·以保護細胞免受活性氧自由基的損傷[20,21]。實驗結(jié)果表明，在較短的暴露時間內(nèi)（1d），梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓組織中的SOD活性能迅速升高，說明 HCB脅迫已產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起 ROS大量生成，從而誘發(fā)了 SOD活性增強，ROS被大量清除，因此又迅速降至對照水平或略低于對照組。隨著暴露時間的進一步延續(xù)，自由基大量積累，過量積累的自由基則對抗氧化酶產(chǎn)生顯著的誘導(dǎo)作用，使 SOD活性代償性增強以平衡螺機體內(nèi)的氧化與抗氧化反應(yīng)[21,22]。當HCB作用濃度過高，暴露時間過長, SOD的清除能力達到飽和時，活性氧大量積累，未被及時清除的自由基可對細胞產(chǎn)生毒性損傷，可導(dǎo)致 SOD活性受抑制[23]。所以在 HCB暴露后期，各劑量組 SOD酶活性急劇下降，并且高劑量組 SOD活性已處于抑制狀態(tài)。蔣舜堯等[24]在研究HCB對鯽魚肝臟線粒體保護酶 SOD、CAT活性的影響時，也有相似的現(xiàn)象出現(xiàn)，酶活性在低濃度受誘導(dǎo)，而高濃度下則受抑制。

3. 2 HCB對梨形環(huán)棱螺CAT活性的影響

過氧化氫酶(CAT)作為 H2O2濃度的調(diào)節(jié)器，可進一步將 H2O2轉(zhuǎn)化成H2O，從而使機體免受活性氧的損傷[25]。HCB暴露起始時，由于 ROS產(chǎn)生及 SOD對活性氧的歧化作用，導(dǎo)致 H2O2升高，刺激體內(nèi) CAT表達釋放和活力增強；當 H2O2被分解后，CAT活性同樣降至對照組附近，即表現(xiàn)出短期激活然后下降的的變化規(guī)律，這與李康等[26]對鯽魚的報道頗為相似。隨著暴露時間延長，一方面由于螺體內(nèi)積累的 HCB激發(fā)了H2O2大量生成，另一方面因 ROS大量生成，導(dǎo)致 SOD應(yīng)激產(chǎn)生歧化反應(yīng)，也產(chǎn)生大量 H2O2，使CAT活性被誘導(dǎo)而增強。但隨后CAT活性顯著下降，這說明 CAT等作為活性氧清除劑，只能在一定程度上清除體內(nèi)過量活性氧，來維持體內(nèi)活性氧代謝平衡，降低脂質(zhì)過氧化作用。一旦 HCB在機體內(nèi)蓄積引起濃度升高，將導(dǎo)致機體產(chǎn)生大量的氧自由基不能及時被清除，進一步對包括抗氧化酶在內(nèi)的細胞胞內(nèi)酶形成抑制，因此其清除活性氧的功能也隨之下降[27]。

3.3 HCB對梨形環(huán)棱螺GST活性的影響

GST是細胞內(nèi)解毒系統(tǒng)Ⅱ階段中具有解毒作用的重要酶蛋白[28]，具有消除體內(nèi)自由基和解毒的雙重功能，它可以催化GSH與許多次級底物結(jié)合，包括脂質(zhì)過氧化的次級產(chǎn)物，從而解除內(nèi)源性或外源性毒物的毒性作用[29]，所以在保護細胞膜免受過氧化損傷中意義重大。本實驗剛開始時，因自由基的生成引發(fā) GST同樣表現(xiàn)出一種應(yīng)激反應(yīng)，酶活性被誘導(dǎo)增強；當活性氧被清除，GST活性降至對照組附近。隨著暴露時間進一步延長，活性氧大量產(chǎn)生，GST與其他抗氧化酶如 SOD、GPx 等在組織中協(xié)同表達而使其活性顯著升高[30]；當 GST達到峰值后，可能由于機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)其他成分如 SOD、CAT等的介入，體內(nèi)活性氧被清除，此時 GST濃度急劇下降，其原因可能是由于螺體內(nèi) GST代謝 HCB的能力被飽和，使螺出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，進而使 GST活性受到抑制[31]。GST在實驗結(jié)束時，也同樣表現(xiàn)出低濃度誘導(dǎo)、高濃度抑制的現(xiàn)象。

3.4 HCB對梨形環(huán)棱螺抗氧化指標GSH的誘導(dǎo)和抑制

GSH是動物體內(nèi)重要的水溶性抗氧化劑，是 GST和 GPx的輔助因子，兩酶均能催化其與污染代謝物和H2O2結(jié)合而達到解毒目的，同時它還能夠清除氧自由基、阻止脂質(zhì)過氧化以保護機體免受氧化損傷[32]，或通過消除有害的脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物如MDA，來阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，從而保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[33]。此過程中 GSH的含量會因污染脅迫而發(fā)生改變。本試驗中，在 HCB暴露的1d內(nèi)，GSH含量就被誘導(dǎo)升高，可能是 GSH因HCB的暴露而產(chǎn)生了適應(yīng)性的誘導(dǎo)反應(yīng)；同時，GSH與 HCB結(jié)合而產(chǎn)生的解毒效應(yīng)又導(dǎo)致GSH消耗。短時間內(nèi)當這兩個過程達到動態(tài)平衡時，GSH含量下降到正常值附近。實驗結(jié)果顯示，隨暴露時間延長GSH含量表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制，這是因為隨著HCB暴露時間進一步延長，自由基大量生成，為調(diào)節(jié)生物體內(nèi)自由基濃度平衡，GSH含量被誘導(dǎo)顯著升高。在一定暴露濃度范圍內(nèi)，GSH 對HCB的適應(yīng)性能力隨著污染程度的增加而降低，HCB對GSH 的抑制效應(yīng)隨著污染程度的增加而加大，GSH因中毒過深而導(dǎo)致其含量降低。GSH達到峰值后，其含量急劇下降，一方面，GSH可直接通過供H+，拮抗氧自由基毒性，本身被氧化而使其含量降低；另一方面，GSH與作為底物的HCB及其代謝物發(fā)生共軛作用也會導(dǎo)致其含量下降[34]。至14d時，中低劑量組的GSH仍顯著高于對照組，而高劑量組已被抑制，表明低濃度HCB可對GSH的含量產(chǎn)生顯著誘導(dǎo)效應(yīng)，而高濃度產(chǎn)生抑制效應(yīng)。張景飛等[12]對鯽魚進行原油暴露實驗時也發(fā)現(xiàn)，低濃度毒物暴露時，GSH被誘導(dǎo)，而高濃度暴露時GSH則被抑制。試驗結(jié)果顯示，HCB的短期暴露就會造成 GSH含量上升，GSH含量顯著降低則暗示著污染的加劇。

4 實驗結(jié)論

HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓中SOD、CAT、GST活性和GSH含量均有明顯影響。各抗氧化指標在HCB暴露后均受到誘導(dǎo)而升高，隨后又回落。隨著暴露時間的延長，各抗氧化指標又呈現(xiàn)出顯著的先上升后下降趨勢，最終表現(xiàn)為低濃度誘導(dǎo)，高濃度抑制。

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