李 妍 杭州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬余杭醫(yī)院 杭州 311100

趙久陽(yáng) 大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是一類以進(jìn)行性腎臟纖維化為特征的疾病。激肽系統(tǒng)（kallikrein-kinin system，KKS）對(duì)于腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化具有明顯的抑制作用[1-2]，而緩激肽（braykinin，BK）是該系統(tǒng)發(fā)揮效應(yīng)的最終作用因子。本實(shí)驗(yàn)采用高糖刺激腎系膜細(xì)胞，使細(xì)胞達(dá)到預(yù)增殖狀態(tài)，以磷酸化JNK 蛋白表達(dá)量代表JNK 通路的活化程度，研究BK 對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞磷酸化JNK蛋白表達(dá)的影響，深入了解BK 對(duì)糖尿病腎病腎纖維化的保護(hù)作用的機(jī)制，為臨床防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 BK（美國(guó)Calbiochem），BK 受體阻斷劑HOE-140（美國(guó)Sigma），RPMI 1640 培養(yǎng)液（美國(guó)GIBCO），D-Glu（美國(guó)Sigma），SP 600125（美國(guó)Santa Cruz），小鼠抗人P-JNK 一抗（美國(guó)Santa Cruz），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠Ig-G 二抗（大連晨玉），胎牛血清（FBS）（天津中科院TBD），醋酸纖維素膜（NC 膜）（美國(guó)Bioshop）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組方法 細(xì)胞來(lái)源：永生代成年大鼠腎小球系膜細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)Cambrex。細(xì)胞培養(yǎng)：于含10%胎牛血清（FCS）的RPMI1640 培養(yǎng)液、5%CO2、37℃的孵箱中傳代培養(yǎng)，生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，饑餓培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步于G0 期，隨后依實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌殖刹煌囼?yàn)組。

實(shí)驗(yàn)分組：按培養(yǎng)液中刺激因素不同分組，每組均為含10%滅活胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液。細(xì)胞分組：①對(duì)照組：培養(yǎng)液中測(cè)定其葡萄糖濃度為5mmol/L。②高糖組：培養(yǎng)液中測(cè)定其葡萄糖濃度為30mmol/L。③緩激肽+高糖組：培養(yǎng)液中緩激肽濃度（100ng/mL）預(yù)孵15min 后，加入葡萄糖濃度30mmol/L。④緩激肽B2 受體阻斷劑＋緩激肽+高糖組：培養(yǎng)液HOE-140（1μmol/L）預(yù)孵15min 后，加入緩激肽100ng/mL 預(yù)孵15min，再加入葡萄糖濃度30mmol/L。⑤JNK 通路阻斷劑＋緩激肽+高糖組：SP-600125（10μmol/L）預(yù)孵15min 后，再加入緩激肽100ng/mL預(yù)孵15min 后，再加入葡萄糖濃度30mmol/L。

1.3 免疫印跡（Western－blotting）法檢測(cè)JNK 信號(hào)通路的激活 依據(jù)分組不同，將細(xì)胞接種在10cm 的培養(yǎng)皿中，生長(zhǎng)至80%融合的系膜細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，然后吸出培養(yǎng)基，換用新的無(wú)血清培養(yǎng)基，并根據(jù)分組加入不同的作用因子，并用含有1mmol/L 釩酸鈉（NaVO4）的冰冷的PBS 沖洗三次終止反應(yīng)，加入蛋白裂解液（預(yù)冷）刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中，超聲粉碎后12 000rpm 4℃離心20min 取上清。上述操作均于冰上進(jìn)行，以避免蛋白降解。蛋白濃度以Bradford 分析法確定。取5μL 樣品，加入95μL 雙蒸水，再加入3mL Bradford 顯色液后立即混勻。用紫外分光光度儀在595nm 下測(cè)定OD 值，作雙管重復(fù)測(cè)定結(jié)果，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。取樣品行SDS-PAGE 電泳，90V 恒壓轉(zhuǎn)膜2h，用5%牛血清封閉過(guò)夜。封閉后的膜與單克隆小鼠抗人磷酸化JNK（Ⅰ抗）4℃雜交孵育1h，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 抗體（Ⅱ抗）室溫孵育雜交1h。抗體均用抗體緩沖液適當(dāng)稀釋，雜交時(shí)輕搖抗體使之與膜均勻、充分接觸，每次雜交完畢均用TTBS洗去殘余未結(jié)合抗體。將硝酸纖維素膜浸于DAB 顯色液中，于暗處觀察，觀察有清晰的特異條帶出現(xiàn)時(shí)，用大量的水沖洗硝酸纖維素膜以終止顯色反應(yīng)。定影，拍照。凝膠掃描分析系統(tǒng)（2020D，美國(guó)Kodak）軟件行圖象掃描及條帶吸光度半定量分析，為消除掃描和分析中的誤差，重復(fù)三次該過(guò)程，并取均值作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0 軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)照組表達(dá)一定基礎(chǔ)水平的磷酸化JNK 蛋白，高糖組較對(duì)照組磷酸化JNK 蛋白的表達(dá)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；BK 加高糖組的磷酸化JNK 的表達(dá)量與高糖組比較明顯減少（P＜0.01），與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；加入BK-B2 受體阻斷劑后，與不加阻斷劑組比磷酸化JNK 蛋白的表達(dá)量增多（P＜0.05），但仍顯著低于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＜0.05）；使用JNK 通路阻斷劑后，JNK 磷酸化蛋白表達(dá)量明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 各組總磷酸化JNK 蛋白表達(dá)量

圖2 磷酸化JNK 蛋白電泳圖（P-JNK 包括P-JNK1和P-JNK2）

3 討論

糖尿病腎病是一類以進(jìn)行性腎臟纖維化為特征的疾病。在腎小球的各種類型細(xì)胞中,系膜細(xì)胞是受高血糖影響最顯著的細(xì)胞。C-Jun 氨基末端激酶（CJunNH2-terminal kinase，JNK）為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）通路成員之一，是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是將胞外刺激信號(hào)傳遞給胞核的主要傳導(dǎo)通路。JNK可被應(yīng)激反應(yīng)如滲透壓的改變、熱休克、炎癥反應(yīng)因子IL-1α、INF－α、DNA 損傷等因素所激活。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，JNK 在腎損傷的早期發(fā)揮重要作用[3]。因此,我們選用系膜細(xì)胞作為研究對(duì)象來(lái)研究BK 對(duì)高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞表達(dá)磷酸化JNK 蛋白的影響，探索BK延緩糖尿病腎病腎小球硬化的機(jī)制。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)（kallikreinkinin system，KKS）對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、細(xì)胞外基質(zhì)的合成及降解起著重要的調(diào)節(jié)作用。BK 的生理作用主要由B2 受體（BKB2R）介導(dǎo)，B1 受體（BKB1R）在生理情況下不表達(dá)，可能在炎癥、缺血或組織損傷等情況下放大BKB2R 介導(dǎo)的效應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)，BK 的作用與MAPK 通路關(guān)系密切，而目前研究比較清楚的是BK 對(duì)ERK 通路的影響。實(shí)驗(yàn)表明，BK 可以調(diào)節(jié)ERK 的激活，BK 通過(guò)抑制ERK 的激活可以調(diào)節(jié)增殖狀態(tài)系膜細(xì)胞的增殖[4-5]。而B(niǎo)K 對(duì)JNK 通路影響的文獻(xiàn)卻很少。

Liu 等[6]報(bào)道，BK 可促進(jìn)鼠的成纖維細(xì)胞JNK磷酸化蛋白的表達(dá)，即BK 可以調(diào)節(jié)JNK 通路的激活。關(guān)于BK 對(duì)系膜細(xì)胞JNK 磷酸化蛋白的影響，目前國(guó)內(nèi)很少報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)BK 對(duì)系膜細(xì)胞的調(diào)節(jié)具有雙向性[4，7]，即作用于靜止?fàn)顟B(tài)的系膜細(xì)胞引起其增殖，而作用于增殖狀態(tài)下的系膜細(xì)胞時(shí)起抑制增殖的作用。本實(shí)驗(yàn)用高糖刺激系膜細(xì)胞，使其處于增殖狀態(tài)，使用B2 受體阻斷劑、JNK 通路阻斷劑（SP600125）后，通過(guò)檢測(cè)磷酸化JNK 蛋白表達(dá)量的變化，觀察BK 對(duì)高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞表達(dá)JNK 磷酸化蛋白的影響。結(jié)果顯示，高糖組表達(dá)JNK 磷酸化蛋白明顯高于對(duì)照組，而B(niǎo)K 可以抑制高糖誘導(dǎo)細(xì)胞的JNK 磷酸化水平，BK-B2 受體阻斷劑可以阻斷BK的抑制作用，使磷酸化JNK 蛋白表達(dá)量增多，說(shuō)明BK 通過(guò)B2 受體抑制高糖誘導(dǎo)的JNK 磷酸化蛋白的表達(dá)。而加用JNK 阻斷劑可完全阻斷這條通路的激活，磷酸化JNK 蛋白表達(dá)明顯減少，且低于對(duì)照組水平（P＜0.01）。本研究發(fā)現(xiàn)BK 可抑制高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞的磷酸化JNK 蛋白的表達(dá)。推測(cè)BK 抑制DN時(shí)的腎纖維化的作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)磷酸化JNK 蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

Makkinje 等[8]研究顯示，JNK 通路在DN 的持續(xù)發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。Ingram 等[9]發(fā)現(xiàn)，高糖（30mmol/L）的機(jī)械牽張（14kPa）可以激活體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞的JNK 通路，而P38MAPK 和ERK 活性變化不明顯。相關(guān)研究報(bào)道高糖環(huán)境下導(dǎo)致的氧化應(yīng)激狀態(tài)，激活JNK/SAPK 途徑，刺激系膜細(xì)胞CTGF、FN的合成，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，最終導(dǎo)致腎小球硬化。而本實(shí)驗(yàn)顯示，BK 可以調(diào)節(jié)JNK 通路的激活從而發(fā)揮抑制糖尿病腎病進(jìn)展的作用。

轉(zhuǎn)錄因子AP-1 是細(xì)胞內(nèi)JNK/SAPK 作用的重要目標(biāo)，JNK 通路被激活后，可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子AP-1 將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核，激活A(yù)P-1 位點(diǎn)的靶基因轉(zhuǎn)錄。核內(nèi)立早基因c-fos、c-jun 編碼的蛋白產(chǎn)物分別形成了Fos 家族（c-Fos、FosB、Foral、Fraz）蛋白和Jun 家族（c-Jun、JunB、Jun 與Fos）二聚體，構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子AP-1。已知單核細(xì)胞趨化蛋白－1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、纖維連接蛋白（FN）、層粘連蛋白B 及細(xì)胞周期素D1 等基因啟動(dòng)子中均存在與AP-1 結(jié)合的作用元件（TRE 元件）。故BK 可能是通過(guò)JNK/SAPK/AP-1 途徑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β、纖維連接蛋白（FN）等基因啟動(dòng)子的結(jié)合而發(fā)揮抑制腎纖維化作用。

綜上所述，BK 作為一種細(xì)胞因子，可通過(guò)調(diào)節(jié)JNK 磷酸化蛋白表達(dá)，來(lái)調(diào)節(jié)JNK 通路的活性，從而在延緩糖尿病腎病腎小球硬化的進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用。

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