楊春蘭 岳麗杰 于 潔 文飛球 李長(zhǎng)鋼 鄭苗苗 謝 偲丁 慧

大劑量甲氨蝶呤（high-dose methotrexate，HD-MTX）加四氫葉酸鈣（CF）解救方案在預(yù)防髓外白血病以提高兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）預(yù)后方面的效果肯定，但是HD-MTX治療時(shí)發(fā)生的嚴(yán)重肝臟和骨髓抑制毒副作用而導(dǎo)致的停藥是ALL復(fù)發(fā)的重要原因之一［1］，因此有必要監(jiān)測(cè)MTX引起的毒副作用及可預(yù)測(cè)其毒副作用的因素。有研究表明胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）基因（TYMS）多態(tài)性可能與MTX治療ALL的療效和毒副作用相關(guān)［2-4］。本研究對(duì)75例ALL兒童的TYMS3'端非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）的多態(tài)性rs699517、rs2790和rs11280056進(jìn)行檢測(cè)，并分析其與52例ALL兒童接受HD-MTX治療時(shí)毒副作用的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象

2004年3月至2010年6月在深圳市兒童醫(yī)院住院經(jīng)骨髓檢查確診的ALL兒童75例，其中男48例，女27例，男女之比為1.8∶1，發(fā)病年齡4個(gè)月至13歲，中位年齡4.25歲。診斷及分型均符合《兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議（第三次修訂草案）》［5］。其中接受HD-MTX化療的有52例，采用改良ALL-IC-BFM2002方案或GD2008 ALL方案，男35例，女17例，發(fā)病年齡6個(gè)月至13歲，平均年齡為（5.13±2.85）歲。B-ALL 48例，T-ALL 4例；標(biāo)危型26例，中危型18例，高危型8例。全部52例均獲得第一次完全緩解，并完成了鞏固化療，應(yīng)用HD-MTX+CF方案預(yù)防髓外白血病。HD-MTX治療前患者一般情況良好，無(wú)嚴(yán)重感染；心電圖、心肌酶、肝腎功能均正常，符合化療條件。鞏固治療時(shí)標(biāo)危型和中危型的患者接受4輪HD-MTX（2 g/m2）治療，高危型患者接受2輪HD-MTX（5 g/m2）治療，在用HD-MTX同時(shí)，每晚頓服巰嘌呤（6-MP）50 mg/m2，所有患者均用CF解救MTX毒性。HD-MTX化療前使用止吐藥；化療期間每日0.1%洗必泰溶液漱口，0.05%利凡諾坐浴，以防止口腔和肛周感染；每日思密達(dá)含漱后口服保護(hù)消化道黏膜。

正常對(duì)照組為本院門(mén)診健康查體兒童83例，其中男58例，女25例，年齡5個(gè)月至12歲，中位年齡4.42歲。正常對(duì)照組亦為中國(guó)漢族兒童，且無(wú)腫瘤病史和家族史。病例組與對(duì)照組在性別、年齡分布方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 MTX毒副作用統(tǒng)計(jì) 每輪HD-MTX輸注完后至下輪開(kāi)始之間或每次HD-MTX輸注完后的14天內(nèi)評(píng)估其毒副作用。分析外周血血紅蛋白、中性粒細(xì)胞、血小板了解骨髓抑制情況；血清ALT、AST升高情況評(píng)估肝臟毒性；血清肌酐和尿素氮升高水平評(píng)估腎毒性；心臟毒性以心率、心律、心功能情況及心肌酶升高水平判斷；神經(jīng)系統(tǒng)毒副作用包括情緒障礙、失眠、嚴(yán)重頭痛、驚厥、癱瘓等；以是否出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛、腸梗阻等判斷消化道毒性；口腔黏膜損害單獨(dú)作為一項(xiàng)進(jìn)行評(píng)估。毒副作用分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采用美國(guó)國(guó)立癌癥研究所的第3版常規(guī)毒性判定標(biāo)準(zhǔn)（NCICTCAE，version3.0）。對(duì)觀察到的最高級(jí)別毒副反應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)［6］。

1.2.2TYMS多態(tài)性檢測(cè) 經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，并獲得正常對(duì)照組兒童和ALL兒童監(jiān)護(hù)人的知情同意后，正常對(duì)照兒童抽取外周靜脈血2.0 mL，初診的ALL兒童在輸血及化療前抽取骨髓液1～1.5 mL。使用QIAamp RNA Blood Mini Kit試劑盒（QIAGEN，德國(guó)）按操作說(shuō)明書(shū)提取總RNA，1 μg總RNA使用Reverse Transcriptase XL試劑盒（大連寶生物公司）逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用巢式PCR擴(kuò)增，在Tprofessional Std Gradient 96熱循環(huán)儀（Biometra公司，德國(guó)）上進(jìn)行，引物由英濰捷基（上海）公司合成，第一次PCR上游引物：5'-AGCGAGAACCCAGACCT T-3'，下 游 引 物 ：5'-TTGACGAATGCAGAACACT T-3'。半巢式PCR上游引物：5'-TACAATCCGCATCCAACTAT-3'，下游引物：與第一次PCR擴(kuò)增下游引物相同。所檢測(cè)的TYMScDNA片段為第1 040位點(diǎn)至1 585位點(diǎn)（從mRNA的第一個(gè)堿基起計(jì)數(shù)），擴(kuò)增后片段長(zhǎng)度為546 bp。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件同文獻(xiàn)［7］。PCR產(chǎn)物送英濰捷基（上海）公司進(jìn)行測(cè)序。所得測(cè)序結(jié)果用Chromas軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用基因計(jì)數(shù)法分別統(tǒng)計(jì)正常對(duì)照組和ALL各組的TYMS多態(tài)性的等位基因及基因型頻率，應(yīng)用SPSS 13.0軟件的χ2檢驗(yàn)分析各組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)全部75例ALL兒童按性別及年齡（＜1歲或≥10歲、1～10歲）各分兩組分析其與TYMS多態(tài)性關(guān)系。對(duì)治療的ALL兒童52例按危險(xiǎn)度、各種MTX毒副作用（＜2級(jí)者、≥2級(jí)者）各分為兩組［8］，分析其與TYMS多態(tài)性的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 HD-MTX相關(guān)的不良反應(yīng)發(fā)生情況

52例接受HD-MTX化療的ALL兒童，出現(xiàn)的主要不良反應(yīng)及分級(jí)情況見(jiàn)表1。

表1 52例ALL兒童HD-MTX治療時(shí)的不良反應(yīng) 例（%）Table 1 Toxicities in 52 ALL children treated with HD-MTX

2.2 ALL兒童TYMS多態(tài)性與年齡、性別、危險(xiǎn)度的關(guān)系

TYMSrs699517、rs2790和rs11280056各基因型頻率在正常對(duì)照組、全部75例ALL兒童和52例接受治療的兒童中均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P＞0.05）。rs699517和rs11280056基因型分布與ALL兒童性別、發(fā)病年齡、危險(xiǎn)度均不相關(guān)（P＞0.05）；TYMSrs2790與ALL兒童發(fā)病年齡、危險(xiǎn)度也無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。在正常對(duì)照組中TYMSrs2790基因型分布與性別無(wú)關(guān)（P＞0.05），但rs2790基因型與ALL兒童的性別相關(guān)，與AA基因型相比，攜帶等位基因G的ALL男孩數(shù)約是女孩的3倍（OR=3.05，95%CI=1.14～8.19，P=0.024），見(jiàn)表2。

2.3 HD-MTX治療的不良反應(yīng)與TYMS多態(tài)性的關(guān)系

將HD-MTX毒副作用（包括骨髓抑制、肝毒性、消化道毒性、口腔黏膜損害）各分為兩組（＜2級(jí)者、≥2級(jí)者），分析rs699517、rs2790和rs11280056各基因型在各種毒副作用兩組中的分布情況，發(fā)現(xiàn)rs2790的基因型與中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生相關(guān)，GG基因型具有保護(hù)作用，其使發(fā)生中性粒細(xì)胞減少的危險(xiǎn)降低（OR=0.07，95%CI=0.01～0.64，P=0.026），這種作用主要體現(xiàn)在ALL男孩組，見(jiàn)表3，4。rs699517和rs11280056與MTX的這些毒副作用均未觀察到相關(guān)性（P＞0.05），而rs2790與除中性粒細(xì)胞減少外的其他MTX毒副作用也無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。

表2 75例ALL兒童和正常對(duì)照組兒童的TYMS多態(tài)性與性別的關(guān)系 例（%）Table 2 Correlation betweenTYMSpolymorphism and gender in the group with 75 childhood ALL patients and normal controls

表3 52例ALL兒童TYMSrs2790與HD-MTX引起的中性粒細(xì)胞減少的關(guān)系Table 3 Relationship betweenTYMSrs2790 and HD-MTX-related neutropenia in 52 cases with childhood ALL

表4 52例ALL兒童TYMSrs2790在不同性別組中與HD-MTX引起的中性粒細(xì)胞減少的關(guān)系Table 4 Relationship betweenTYMSrs2790 and HD-MTX-related neutropenia in the group with 52 childhood ALL cases of different genders

3 討論

MTX通過(guò)抑制二氫葉酸還原酶，使細(xì)胞內(nèi)TS合成dTMP的底物之一的5，10-亞甲基四氫葉酸產(chǎn)生不足，同時(shí)也可直接抑制TS酶活性，使DNA合成障礙，達(dá)到細(xì)胞毒作用而抗腫瘤［9］。CF的解救一定程度上減少M(fèi)TX對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用，但MTX毒副作用卻不可避免。本研究結(jié)果顯示HD-MTX治療兒童ALL時(shí)毒副作用較為常見(jiàn)，但多輕微，其中不同程度的骨髓抑制和肝功能損害最為常見(jiàn)，其次為消化道反應(yīng)、口腔黏膜損害等，大部分患兒對(duì)這些毒副作用可耐受，此研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)多家報(bào)道相近，可能由于保肝治療時(shí)機(jī)的不同，在肝功能損害發(fā)生率上存在明顯差異。

本研究結(jié)果表明TYMSrs2790與ALL兒童的性別相關(guān)，與AA基因型相比，攜帶等位基因G者男孩數(shù)約是女孩的3倍，而在正常對(duì)照組兒童中此多態(tài)性基因型分布在性別上無(wú)顯著性差異，考慮患ALL的男孩攜帶等位基因G的比例較高。此外，本研究結(jié)果也表明TYMSrs2790的基因型與HD-MTX引起的中性粒細(xì)胞減少發(fā)生相關(guān)，GG基因型具有保護(hù)作用，其使發(fā)生中性粒細(xì)胞減少的危險(xiǎn)降低，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)此種保護(hù)作用主要出現(xiàn)在ALL男孩組，TYMSrs2790 GG基因型的ALL男孩在HD-MTX治療時(shí)發(fā)生中性粒細(xì)胞減少的危險(xiǎn)明顯降低（OR=0.044，95%CI=0.003～0.662，P=0.028），此方面的文獻(xiàn)報(bào)道較少。此外，TYMSrs699517和rs11280056與HD-MTX的毒副作用無(wú)相關(guān)性，而rs2790與除中性粒細(xì)胞減少外的其他MTX毒副作用也無(wú)相關(guān)性。

研究表明TYMS多態(tài)性可能改變其轉(zhuǎn)錄或翻譯水平而改變TS蛋白表達(dá)［10］，可能與MTX對(duì)機(jī)體的毒副作用相關(guān)。Er?ulj等［3］對(duì)斯洛文尼亞ALL兒童研究發(fā)現(xiàn)，TYMS5'-UTR 3R等位基因降低貧血、白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥等MTX引起的骨髓抑制毒副作用的發(fā)生，同時(shí)其可降低總的MTX毒副反應(yīng)發(fā)生危險(xiǎn)。另外，3R/3R基因型增加成人ALL MTX治療引起的貧血發(fā)生危險(xiǎn)［4］。國(guó)內(nèi)外均鮮見(jiàn)TYMS3'-UTR多態(tài)性rs699517、rs2790和rs11280056與ALL兒童的MTX毒副反應(yīng)關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道。

綜上，本研究表明TYMS多態(tài)性與ALL兒童HD-MTX毒副作用存在一定相關(guān)性，TYMSrs2790 GG基因型可能降低HD-MTX導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生危險(xiǎn)，這可能為ALL兒童化療個(gè)體化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于TYMS多態(tài)性存在顯著的種族差異且本研究病例數(shù)相對(duì)較少，TYMS多態(tài)性與ALL兒童HD-MTX毒副作用的相關(guān)性仍需更大樣本量、多民族地區(qū)的進(jìn)一步研究。

1 Costea I,Moghrabi A,Laverdiere C,et al.Folate cycle gene variants and chemotherapy toxicity in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia[J].Haematologica,2006,91(8):1113-1116.

2 da Silva Silveira V,Canalle R,Scrideli CA,et al.Polymorphisms of xenobiotic metabolizing enzymes and DNA repair genes and outcome in childhood acute lymphoblastic leukemia[J].Leuk Res,2009,33(7):898-901.

3 Er?ulj N,Kotnik BF,Debeljak M,et al.Influence of folate pathway polymorphisms on high-dose methotrexate-related toxicity and survival in childhoodacute lymphoblastic leukemia[J].Leuk Lymphoma,2012,53(6):1096-1104.

4 Ongaro A,De Mattei M,Della Porta MG,et al.Gene polymorphisms in folate metabolizing enzymes in adult acute lymphoblastic leukemia:effects onmethotrexate-related toxicity and survival[J].Haematologica,2009,94(10):1391-1398.

5 中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液組,中華兒科雜志編輯委員會(huì).兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議(第三次修訂草案)[J].中華兒科雜志,2006,44(5):392-395.

6 Liu SG,Li ZG,Cui L,et al.Effects of methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms on toxicities during consolidation therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia in a Chinese population[J].Leuk Lymphoma,2011,52(6):1030-1040.

7 張洪洪,岳麗杰,袁秀麗,等.GGH基因多態(tài)性研究及一個(gè)新的錯(cuò)義突變T191G的發(fā)現(xiàn)[J].中國(guó)腫瘤臨床,2012,39(4):185-188.

8 Chen X,Wen F,Yue L,et al.Genetic polymorphism of γ-glutamyl hydrolase in Chinese acute leukemia children and identification of a novel double nonsynonymous mutation[J].Pediatr Hema-tol Oncol,2012,29(4):303-312.

9 Huang L,Tissing WJ,de Jonge R,et al.Polymorphisms in folate-related genes:association with side effects of high-dose methotrexate in childhoodacute lymphoblastic leukemia[J].Leukemia,2008,22(9):1798-1800.

10 Zhang Q,Zhao YP,Liao Q,et al.Associations between gene polymorphisms of thymidylate synthase with its protein expression andchemosensitivity to 5-fluorouracil in pancreatic carcinoma cells[J].Chin Med J(Engl),2011,124(2):262-267.