袁海鋒 郭 文 李新艷 朱明古

芥菜籽（mustard seed，MS）是十字花科蕓苔屬植物芥菜的種子，其加工的產(chǎn)品芥末油和芥末粉是日常生活中常用的調(diào)味品。芥菜籽能否作為一種化學預(yù)防劑應(yīng)用于大腸癌的預(yù)防，目前這方面的研究尚鮮見。本研究以氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）誘導(dǎo)的小鼠大腸腫瘤為研究對象，評價芥菜籽對化學誘導(dǎo)大腸腫瘤的預(yù)防作用，并觀察其對小鼠體內(nèi)自由基水平和抗氧化酶活性的影響，從自由基反應(yīng)與腫瘤發(fā)生的角度探討芥菜籽預(yù)防大腸癌發(fā)生的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 誘癌劑氧化偶氮甲烷（AOM）購自Sigma公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）測定試劑盒及丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實驗動物 清潔級昆明品系小鼠購自南方醫(yī)科大學動物實驗中心。芥菜籽（MS）購自廣州長合種子有限公司，在動物中心加工制成含5%MS和10%MS的顆粒飼料。昆明種小鼠，4周齡，體質(zhì)量18～20 g，飼養(yǎng)于南方醫(yī)院動物實驗中心。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理 60只昆明品系小鼠隨機均分為：1）AOM模型組：皮下注射10 mg/kg，1次/周，共3次，標準飼料飲食；2）AOM+5%MS干預(yù)組：AOM誘發(fā)腫瘤同時給予含5%MS飼料飲食干預(yù)；3）AOM+10%MS干預(yù)組：AOM誘發(fā)腫瘤同時給予含10%MS飼料飲食干預(yù)；4）正常對照組：每周給予等量生理鹽水皮下注射，標準飼料飲食。

1.2.2 觀察指標和取材 實驗結(jié)束時，摘眼球取血，檢測抗氧化酶的活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的水平。頸椎脫臼處死，解剖小鼠大腸，肉眼仔細觀察并記錄腫瘤發(fā)生的部位、數(shù)目和大小，觀察其他臟器有無轉(zhuǎn)移病灶發(fā)生。肉眼觀察后將腫瘤組織放入10%福爾馬林溶液中固定。

1.2.3 HE染色 腫瘤組織標本在10%福爾馬林溶液中固定24 h，脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，HE染色，中性樹膠封片。

1.2.4 血清SOD、CAT、GSH-PX活性和MDA含量的檢測 采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD的活性；采用可見光分光光度法檢測CAT的活性；采用化學比色法檢測GSH-PX的活性；采用硫代巴比妥酸法檢測血清過氧化脂質(zhì)產(chǎn)物MDA的含量。具體操作嚴格按照試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。應(yīng)用卡方檢驗（Chi-square test）比較各組間小鼠大腸腫瘤發(fā)生率的差異，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用SNK方法進行分析，所有分析結(jié)果取雙側(cè)P值，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察

整個實驗過程中，10%MS干預(yù)組有3只小鼠意外死亡，發(fā)生在實驗的24、26、30周，解剖未發(fā)現(xiàn)腫瘤和特殊病變。MS干預(yù)組小鼠一般狀態(tài)和營養(yǎng)狀況明顯好于AOM模型組小鼠。

2.2 肉眼觀察

正常對照組小鼠未發(fā)現(xiàn)大腸腫瘤，其余各實驗組小鼠腸黏膜均有不同程度的增厚、皺襞紊亂，大多向腸腔突出（圖1）。其他臟器解剖均未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移病灶，三組小鼠腫瘤發(fā)生率之間的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.607，P=0.048）。

圖1 AOM誘導(dǎo)的小鼠大腸腫瘤的大體形態(tài)（箭頭所示）Figure 1 Morphology of AOM-induced colorectal tumors in mice

2.3 病理組織學檢查

AOM模型組小鼠平均腫瘤數(shù)與5%MS干預(yù)組和10%MS干預(yù)組小鼠平均腫瘤數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（表1）。三組小鼠大腸癌發(fā)生率之間的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.787，P=0.034），以模型小鼠73.3%的發(fā)生率為最高，10%MS干預(yù)組的25.0%為最低。

2.4 芥菜籽對小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響

AOM模型組小鼠血清SOD的活力明顯低于正常對照組，有顯著性差異（P＜0.05）；MS干預(yù)組小鼠血清SOD的活力與AOM模型組相比均有所提高，有顯著性差異（P＜0.05）；其中10%MS干預(yù)組增加小鼠血清SOD活力的作用最明顯，與5%MS干預(yù)組相比較有顯著性差異（P＜0.05，表2，圖2）。

2.5 芥菜籽對小鼠血清過氧化氫酶（CAT）活力的影響

AOM模型組小鼠血清CAT的活力明顯低于正常對照組，有顯著性差異（P＜0.05）；MS干預(yù)組小鼠血清CAT的活力與AOM模型組相比均有所提高，有顯著性差異（P＜0.05）；其中10%MS干預(yù)組提高小鼠血清CAT活力的效果最好，與5%MS干預(yù)組相比有顯著性差異（P＜0.05，表2，圖3）。

表1 芥菜籽對氧化偶氮甲烷（AOM）誘導(dǎo)小鼠大腸腫瘤發(fā)生的影響Table 1 Effect of mustard seeds on AOM-induced colorectal cancer in mice

表2 芥菜籽對小鼠血清SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA含量的影響Table 2 Effect of mustard seeds on SOD，CAT and GSH-PX activities and MDA content in the serum of mice

圖2 芥菜籽對小鼠血清SOD活力的影響Figure 2 Effect of mustard seeds on SOD activity in mouse serum

2.6 芥菜籽對小鼠血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力的影響

AOM模型組小鼠血清GSH-PX的活力明顯低于正常對照組，有顯著性差異（P＜0.05）；MS干預(yù)組小鼠血清GSH-PX的活力與AOM模型組相比均有所提高，具有顯著性差異（P＜0.05）；其中10%MS干預(yù)組增加小鼠血清GSH-PX活力的作用最明顯，與5%MS干預(yù)組相比有顯著性差異（P＜0.05，表2，圖4）。

2.7 芥菜籽對小鼠血清丙二醛（MDA）含量的影響

AOM模型組小鼠血清脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物及其降解產(chǎn)物-丙二醛（MDA）的含量明顯高于正常對照組，有顯著性差異（P＜0.05）；MS干預(yù)組小鼠血清MDA的含量與AOM模型組相比均有所下降，有顯著性差異（P＜0.05）；其中10%MS干預(yù)組降低小鼠血清MDA的效果最明顯，與5%MS干預(yù)組相比有顯著性差異（P＜0.05，表2，圖5）。

3 討論

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，芥菜籽及其活性提取物均具有抗癌防癌的活性［1-3］。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，本實驗芥菜籽濃度使用5%和10%。AOM誘導(dǎo)小鼠大腸癌的發(fā)生與人類大腸癌發(fā)生過程中細胞動力學、病理組織學和分子特征方面的變化特點非常相似，是大腸癌常用致癌劑［4-7］。

本實驗結(jié)束時，AOM模型組小鼠大腸腫瘤發(fā)生率為86.7%，與以往文獻報道的AOM誘導(dǎo)時間和腫瘤發(fā)生率相一致［8］。本研究結(jié)果表明，芥菜籽對AOM誘導(dǎo)的小鼠大腸腫瘤具有明顯的化學預(yù)防作用，腫瘤的發(fā)生率降低了一半以上。

腫瘤發(fā)生是由于細胞電子平衡失調(diào)所致。自由基是一種缺乏電子的物質(zhì)，進入人體后到處爭奪電子，若奪去細胞蛋白分子的電子，使蛋白質(zhì)接上支鏈發(fā)生烷基化，形成畸變的分子而致癌。該畸變分子由于本身缺少電子，又要去奪取鄰近分子的電子，又使鄰近分子也發(fā)生畸變而致癌。自由基不僅損傷細胞，在致癌和促癌過程中也起重要的作用［9］。自由基能引起細胞膜脂質(zhì)過氧化，改變蛋白質(zhì)、酶的活性，損傷線粒體，攻擊DNA，誘導(dǎo)基因突變［10］。生物機體主要通過自由基清除酶來防止自由基損傷，目前已知生物體內(nèi)的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等，其可分別作用于自由基鏈鎖反應(yīng)的不同環(huán)節(jié)，在體內(nèi)擔負著清除自由基的重要任務(wù)。

本研究結(jié)果表明，在AOM化學致癌過程中，芥菜籽能提高體內(nèi)抗氧化酶的活性，降低體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的水平，從而減輕自由基對機體的損傷，預(yù)防細胞基因突變和癌變。以維生素E為代表的抗氧化劑缺點是在提高機體抗氧化能力的同時，卻降低機體抗氧化酶的表達，因而長期服用這類抗氧化劑，并不能達到我們預(yù)計的保護效果。因而，使用一個既可以具有自身抗氧化能力、又具有提高抗氧化酶表達的純天然保健食品，是目前市場上急需的產(chǎn)品。

本研究證實，芥菜籽不僅可以降低血清中自由基產(chǎn)物MDA，而且可以提高SOD、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等主要抗氧化酶的活性，是一個兼顧抗氧化劑和抗氧化酶兩個抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)特點、具有抗腫瘤的理想的保健食品。芥菜籽來源于天然植物，在我國產(chǎn)量較大，深入研究其抗癌防癌的作用機制，必將促進芥菜籽進一步的應(yīng)用。

1 Half E,Arber N.Colon cancer:preventive agents and the present status of chemoprevention[J].Expert Opin Pharmacother,2009,10(2):211-219.

2 Forte A,De Sanctis R,Leonetti G,et al.Dietary chemoprevention of colorectal cancer[J].Ann Ital Chir,2008,79(4):261-267.

3 Ferrucci LM,Daniel CR,Kapur K,et al.Measurement of spices and seasonings in India:opportunities for cancer epidemiology and prevention[J].Asian Pac J Cancer Prev,2010,11(6):1621-1629.

4 Kauntz H,Bousserouel S,Gosse F,et al.Silibinin,a natural flavonoid,modulates the early expression of chemoprevention biomarkers in a preclinicalmodel of colon carcinogenesis[J].Int J Oncol,2012,41(3):849-854.

5 Guan F,Liu AB,Li G,et al.Deleterious effects of high concentrations of(-)-epigallocatechin-3-gallate and atorvastatin in mice with coloninflammation[J].Nutr Cancer,2012,64(6):847-855.

6 Aviello G,Romano B,Borrelli F,et al.Chemopreventive effect of the non-psychotropic phytocannabinoid cannabidiol on experimental colon cancer[J].J Mol Med(Berl),2012,90(8):925-934.

7 Kim JH,Hue JJ,Kang BS,et al.Effects of selenium on colon carcinogenesis induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate in mousemodel with high-iron diet[J].Lab Anim Res,2011,27(1):9-18.

8 Rosenberg DW,Giardina C,Tanaka T.Mouse models for the study of colon carcinogenesis[J].Carcinogenesis,2009,30(2):183-196.

9 Santos IS,Ponte BM,Boonme P,et al.Nanoencapsulation of polyphenols for protective effect against colon-rectal cancer[J].Biotechnol Adv,2012[Epub ahead of print].

10 Esfahani A,Ghoreishi Z,Nikanfar A,et al.Influence of chemotherapy on the lipid peroxidation and antioxidant status in patients with acute myeloidleukemia[J].Acta Med Iran,2012,50(7):454-458.