★ 肖移生 廖夫生 趙志冬 左愛仁 朱大誠

（江西中醫(yī)學院 南昌 330004）

水蛭俗稱螞蝗，性咸、苦、平，歸肝經(jīng)，有破血、逐瘀、通經(jīng)等功效，用于治癥瘕、痞塊、血瘀閉經(jīng)、跌打損傷等，其藥理作用為抗凝、溶栓、抗血小板及降血脂等[1]；臨床上水蛭也可單方或組方運用于腫瘤治療中[2]。但現(xiàn)有的研究、應用水蛭治療腫瘤是抗實體腫瘤，然而水蛭是否具有抗血液系統(tǒng)腫瘤的作用目前尚未見相關文獻報道。因此，我們采用HL-60細胞作為髓系白血病研究的工具細胞，探討水蛭提取物對其體外抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養(yǎng)方法

HL60細胞由江西中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院實驗中心保存，將HL60細胞培養(yǎng)于含有10%新生小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中（37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)），培養(yǎng)至細胞處于對數(shù)生長期用于后續(xù)實驗。

1.2 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)基及新生小牛血清為美國GIB-CO公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 藥物

水蛭原藥材購于江西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)我校中藥生藥教研室鑒定且符合國家中藥臨床應用標準。水蛭用超微粉碎機粉碎，提取物以液氮快速凍融法制備[3]：取水蛭超微粉1.5g置15mL離心管內(nèi)，加10mL無菌雙蒸水制成混懸液，再將離心管置液氮內(nèi)5min，取出，立即放入37℃水浴中迅速融解，重復3次，再3 000 r/min離心10min。取上清液過濾，濾液冷凍干燥18h即得水蛭凍干粉，-20℃保存?zhèn)溆茫R用前用培養(yǎng)基配成實驗所需濃度工作液，再經(jīng)0.22μm無菌濾器正壓過濾除菌。

1.4 HL60細胞生長曲線繪制

取對數(shù)生長期的細胞接種于25mL的培養(yǎng)瓶，接種濃度為1.0×105/mL，每瓶培養(yǎng)液為4mL，根據(jù)預試驗結果，實驗組加入0.05、0.1、0.5、1.0mg/mL濃度的水蛭提取物連續(xù)處理，對照組不加藥；每隔24h隨機取樣，臺盼藍染色法計數(shù)活細胞（同一處理計數(shù)10瓶細胞取平均值），光鏡下計數(shù)活細胞數(shù)，以時間為橫坐標，每毫升活細胞數(shù)為縱坐標繪制生長曲線。

1.5 MTT試驗

取對數(shù)生長期的HL60細胞以5.0×104/mL細胞濃度置于96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，同時用水蛭提取物（終濃度0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mg/mL）再處理HL60細胞48h，同時設對照孔，到時間點后各孔加入MTT液20μL/孔，每次10復孔，4h后終止培養(yǎng)，以1 000r/min離心5min，去除上清，加入DMSO（150 μL/孔）使結晶物溶解，用自動酶標儀波長490nm處測吸光度A值，實驗重復5次，得出量效關系。按下列公式計算細胞抑制率：細胞生長抑制率（%）=（對照孔A值-試驗孔A值）／對照孔A值×100%。根據(jù)不同藥物濃度條件下細胞生長抑制率數(shù)值進行相關回歸分析，并根據(jù)回歸方程計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。以1/2 IC50含藥量作為進一步實驗起始工作濃度。

1.6 克隆形成試驗

根據(jù)文獻[4]改進集落形成試驗，將對數(shù)生長期的HL60細胞（1.0×103/mL細胞濃度）、10%新生小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液、各濃度水蛭提取物（根據(jù)前兩項試驗結果，設0.7、1.4、2.8mg/mL）和終濃度為0.3%的瓊脂充分混勻，正常對照組不加水蛭提取物，然后接種于35mm培養(yǎng)皿中（1.5mL/皿），每組10個皿，置于37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)5d。在終止培養(yǎng)之時，倒置顯微鏡下計數(shù)每皿集落數(shù)，≥40個細胞的細胞團為1個集落，結果取平均值。

1.7 Hoechst33342熒光染色檢測

各個濃度水蛭提取物（設0.7、1.4、2.8mg/mL）處理HL60細胞48h后，加入終濃度為10μg/mL的Hoechst 33342并于37℃孵育30min，再加入終濃度為1%的多聚甲醛于暗處固定細胞30min。暗處離心棄上清，取細胞涂片并用封片液封片于載玻片上。熒光顯微鏡下觀察結果。在高倍鏡下隨機計數(shù)200個細胞并照相。計算凋亡率：凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)÷計數(shù)的細胞總數(shù)×100%。實驗重復10次，結果取平均值。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 水蛭提取物對HL60細胞生長的影響

正常對照組細胞經(jīng)過72h完成對數(shù)生長期，然后達到平臺期；0.05mg/mL水蛭提取物對細胞抑制不明顯；0.1-1.0mg/mL濃度的水蛭提取物對HL60細胞有明顯的抑制作用，并呈時間和劑量依賴性。其中1.0mg/mL水蛭提取物組的細胞增殖緩慢，48h達高峰，隨后數(shù)量下降，故后續(xù)試驗取水蛭提取物作用HL60細胞48h為觀察時間點。見圖1。

圖1 不同濃度水蛭提取物對HL60細胞的影響

2.2 水蛭提取物對HL60細胞增殖的抑制作用

各濃度的水蛭提取物處理HL60細胞48h后，MTT檢測結果顯示水蛭提取物以劑量依賴性方式抑制HL60細胞增殖，抑制率隨水蛭提取物濃度增高而增加。0.05mg/mL組與正常組比較無統(tǒng)計學差異，其余各組與正常組比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

運用統(tǒng)計軟件計算出水蛭提取物對HL60相關抑制率的相關直線回歸方程為y（增殖抑制率）=12.364x（藥物濃度）-17.201，經(jīng)計算作用HL60細胞48h時的水蛭提取物IC50=1.4mg/mL。故后續(xù)試驗將水蛭提取物設為0.7、1.4、2.8mg/mL 3個劑量作用HL60細胞48h時間段進行研究。

表1 水蛭提取物處理48h后對HL60細胞增殖抑制作用

2.3 水蛭提取物對HL60細胞系克隆形成的影響

HL60細胞系克隆形成試驗結果，正常對照組克隆數(shù)為88.4±6.5，用不同濃度的水蛭提取物作用HL60細胞48h，克隆形成明顯減少，兩者成反比關系，即藥物濃度越大，克隆形成越少。各藥物組與正常對照組比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

2.4 水蛭提取物誘導HL60細胞凋亡

正常對照組HL60細胞大小一致，形態(tài)正常，細胞漿及核內(nèi)染色質(zhì)呈均勻藍色熒光；各藥物組可見較多的細胞表現(xiàn)為核染色質(zhì)凝集致密濃染，熒光增強，細胞核染色質(zhì)固縮或碎裂成2塊以上即為凋亡細胞；各藥物組凋亡細胞量較正常對照組明顯增多，且呈劑量依賴關系，與正常對照組比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。見表2、圖2。

表2 水蛭提取物對HL60細胞系集落形成及誘導HL60細胞凋亡的影響

3 討論

水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有破血、逐瘀、通經(jīng)等功效，廣泛用于心腦血管及血栓性疾病的治療，水蛭也是腫瘤疾病治療中常用的一味活血藥?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)水蛭抗腫瘤的主要活性成份有凝血酶抑制劑及蛋白酶抑制劑等，含量中主要是水蛭素、溶纖素等，這些都是小分子肽，對熱敏感。不同的提取方法，會極大的影響水蛭藥效[5]。本研究采用液氮快速凍融法制備水蛭提取物，這種低溫炮制工藝可以有效減少和防止炮制過程中水蛭多肽和蛋白類活性成分的降解與變性失活，從而顯著提高了藥效[6、7]。

本課題組進行了水蛭提取物抗人白血病HL60細胞體外增殖藥效研究，發(fā)現(xiàn)水蛭提取物濃度高于0.1mg/mL時對HL60細胞有明顯的抑制作用，并呈時間和劑量依賴性。經(jīng)計算作用HL60細胞48h時的水蛭提取物IC50=1.4mg/mL，故后續(xù)試驗將水蛭提取物設為0.7、1.4、2.8mg/mL 3個劑量作用HL60細胞48h時間段進行研究。運用克隆形成實驗也發(fā)現(xiàn)0.7-2.8mg/mL濃度的水蛭提取物作用HL60細胞48h，藥物濃度越大，克隆形成越少，克隆形成與藥物濃度成反比。這進一步說明水蛭提取物對HL60細胞有明顯的抑制作用。

田雪飛等[8]運用MTT檢測方法發(fā)現(xiàn)水蛭提取物對人肝癌HepG2細胞有體外抑制作用的范圍在3.0-15mg/mL，其作用HepG2細胞48h時的半數(shù)有效抑制濃度IC50=6.0mg/mL。運用同樣的方法制備水蛭提取物，我們得出水蛭提取物作用HL60細胞48h時的IC50=1.4mg/mL。兩者相差較大，可能是細胞不同，對藥物的敏感也不同所致。運用Hoechst33342熒光檢測結果，0.7、1.4、2.8mg/mL提取物誘導HL60細胞凋亡率分別為18.45±5.25、25.61±7.70、30.38±6.89，說明水蛭提取物有一定的誘導HL60細胞凋亡作用。這也是水蛭提取物對HL60細胞抑制機理之一，但詳細機制還需進一步研究。

[1]周樂，趙文靜，常惟智.水蛭的藥理作用及臨床應用研究進展[J].中醫(yī)藥信息，2012，29（1）：132-133.

[2]張娟，張媛.淺談水蛭在腫瘤疾病中的運用[J].湖南中醫(yī)雜志，2006，22（4）：69.

[3]郭永良，田雪飛，肖竺.水蛭提取物對人肝癌HepG2細胞體外抑制作用研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2009，16（8）：30-31.

[4]Puissant A，Groaso S，Jacquel A，et al.Imatinib mesylate-resistant human chronic myelogenous leukemia cell lines exhibit high sensitivity to the phytoalexin resvemtroi[J].The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology，2008，22（6）：1 894-1 904．

[5]王艷，楊培民，代龍，等.水蛭提取方法及生理活性的研究[J].中國生化藥物雜志，2012，33（1）：27-30.

[6]王厚偉.低溫炮制工藝對水蛭水溶性蛋白組成及纖溶活性的影響[J].中藥材，2007，30（3）：272-275.

[7]周春陽，鄭燕林，盛榮，等.不同方法水蛭提取液對體外培養(yǎng)LEC影響的實驗研究[J].四川中醫(yī)，2006，24（7）：12-13.

[8]田雪飛，孫婧，方圓，等.水蛭提取物對肝癌HepG2細胞DNA去甲基化作用研究[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2011，31（9）：8-11.