★ 高龍?zhí)?王智勇 吳俊霞 王飛 汪建民*

（1.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 33004；2.上海市百神健康投資管理有限公司 上海 200030）

慢性腦缺血性疾病深深困擾著我們的健康，尤其在進(jìn)入老齡化社會(huì)的中國(guó)，65歲以上的老年人已經(jīng)達(dá)到1.35億（占全國(guó)人口的8%），而其中患有腦血管疾病的老年人群占到13.6%，腦血管疾病而今已是全球老年人的第一大殺手[1]。中藥在腦缺血性疾病的應(yīng)用越來(lái)越受到重視，從葛根、三七到熱點(diǎn)的銀杏、梔子等，眾多實(shí)驗(yàn)研究和相關(guān)新型中成藥的研制開(kāi)發(fā)都驗(yàn)證了這些中藥的有效性。中藥在治療腦缺血性疾病上有“多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、整體干預(yù)”的特點(diǎn)，在防治慢性缺血性疾病方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和臨床效果。Adachi和余芬等實(shí)驗(yàn)研究已證明DNA損傷和修復(fù)失衡所造成的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦缺血性疾病的重要發(fā)病機(jī)制[2，3]。本項(xiàng)目通將梔子苷口服給藥于慢性腦缺血模型大鼠，采用TUNEL染色和免疫組化染色方法檢測(cè)梔子苷對(duì)慢性腦缺血大鼠神經(jīng)元凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax陽(yáng)性表達(dá)的影響，并從抗凋亡的角度探討梔子苷的神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制，為梔子苷治療慢性腦缺血疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)選用清潔級(jí)雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠40只，體重280±20g，由江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：JZDW-NO：2011-0106，許可證號(hào)：SCXK（贛）2005-0001。

1.2 藥物

梔子苷口服溶液：取梔子苷提取物，加入甘露醇、尼泊金甲酯加水溶解，即得。梔子苷（含量96.2%）由四川雙子葉生物有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：syz090911。

1.3 試劑

TUNEL原位基因凋亡檢測(cè)試劑盒，rocel公司（批號(hào)：11684817910）；兔抗Bcl-2多克隆抗體，Santa cruz公司（批號(hào)：B2208）；兔抗Bax多克隆抗體，Santa cruz公司（批號(hào)：J2407）；牛血清白蛋白，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)：F20070228）；小鼠SP檢測(cè)試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（SP-9001）。

1.4 儀器與設(shè)備

石蠟切片機(jī)（RM2135型），德國(guó)Leica公司；電子天平（DT10K），江蘇常熟長(zhǎng)青儀器儀表廠；恒溫箱（PH140A型），上海一恒科技有限公司；顯微照相儀（leika，Bp-3000），德國(guó)Leica公司。

2 方法

2.1 分組

將40只SD大鼠隨機(jī)分成4組：假手術(shù)組（10只），慢性腦缺血模型組（10只），口服給藥組（10只），陽(yáng)性藥物安理申對(duì)照組（10只）。其中除了假手術(shù)組外的其它各組大鼠均采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）永久性結(jié)扎法（2-VO法）[4，5]進(jìn)行慢性腦缺血造模，假手術(shù)組只剝離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎。4組大鼠均分籠飼養(yǎng)，溫度（25±2℃），濕度50%-60%，自然晝夜節(jié)律，自由飲水，保持室內(nèi)安靜。

2.2 給藥

梔子苷溶液口服給藥組，給藥劑量50 mg/（kg?d）、安理申對(duì)照組，給藥劑量1.75 mg/（kg?d），假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水灌胃，按體表面積計(jì)算[6]各給藥組連續(xù)給藥30d，每d給藥1次。

2.3 TUNEL原位DNA凋亡檢測(cè)和免疫組化檢測(cè)

給藥就術(shù)后，將所有大鼠經(jīng)左心室用4%多聚甲醛灌注固定，切取包含大腦海馬及扣帶回壓部皮質(zhì)等部位的腦組織塊，行冠狀位連續(xù)切片，片厚5 μm。每隔5片取一張，每個(gè)動(dòng)物相鄰切片分為3套，每套各2張，選取其中一套運(yùn)用TUNEL原位DNA凋亡檢測(cè)，剩余兩套分別運(yùn)用兔抗Bax多克隆抗體（工作濃度1：100）和兔抗Bcl-2多克隆抗體（工作濃度1：50）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并觀察其陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)部位。光鏡下（10×20倍）對(duì)每一腦片的海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)和扣帶回皮質(zhì)的外顆粒及錐體區(qū)4個(gè)腦區(qū)進(jìn)行觀察拍照，每個(gè)腦區(qū)隨機(jī)選取相鄰3個(gè)視野，通過(guò)鏡下計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元Bcl-2和Bax免疫陽(yáng)性神經(jīng)元，取各組的各區(qū)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)的平均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 TUNEL原位DNA凋亡檢測(cè)結(jié)果

由表1可知：模型組與假手術(shù)組相比較，各腦區(qū)TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增多，表明相對(duì)的神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯，其差異均有極顯著性意義（P＜O.01），此結(jié)果說(shuō)明永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈所致慢性低灌注腦缺血造模成功?？诜o藥組與模型組相比較，海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)、扣帶回皮質(zhì)的粒上層4個(gè)腦區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)明顯減少，差異均有極顯著性意義（P＜O.01），此結(jié)果說(shuō)明口服梔子苷對(duì)慢性腦缺血所致的神經(jīng)元損傷具有較好的抗凋亡作用?？诜o藥組與安理申對(duì)照組相比較，除皮質(zhì)區(qū)的TUEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)略低于安理申組外，差異無(wú)顯著性意義（P＞0.05），其余各腦區(qū)TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)均略高于安理申對(duì)照組，其中CA1區(qū)和CA3區(qū)差異均有顯著性意義（P＞0.05）外，CA2區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目只有顯著性差異（P＜0.05），此結(jié)果說(shuō)明口服梔子苷與安理申的慢性腦缺血性神經(jīng)抗凋亡作用具有相似效果。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠海馬各區(qū)和皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠海馬各區(qū)和皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元比較（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型組比較，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01；與安理申對(duì)照組比較，◆表示P＜0.05，◆◆表示P＜0.01

后扣帶回皮質(zhì)區(qū)33.23±1.33▲▲◆◆77.00±2.36**◆◆42.23±4.50*▲▲43.30±2.65**▲▲組別假手術(shù)組模型組口服給藥組安理申對(duì)照組海馬CA1區(qū)30.67±2.89▲▲◆◆67.90±4.00**◆◆40.67±2.71**▲▲39.58±5.37**▲▲海馬CA2區(qū)25.33±0.65▲▲36.43±2.80**◆◆27.23±1.74▲▲◆23.57±1.50▲▲海馬CA3區(qū)17.03±1.53▲▲◆◆37.00±0.89**◆◆24.33±2.06**▲▲21.67±3.35**▲▲

3.2 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

3.2.1 各組大鼠Bcl-2免疫組化結(jié)果 見(jiàn)表2。

由表2可知：模型組與假手術(shù)相比較，大鼠各腦區(qū)Bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)明顯較少，差異均有極顯著性意義（P＜0.01），口服給藥組與模型組相比較，各腦區(qū)Bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增多，差異均有極顯著性差異（P＜0.01），口服給藥組與安理申對(duì)照組相比較，各腦區(qū)Bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目均比安理申組略多，差異均無(wú)顯著性意義（P＞0.05），結(jié)果表明，梔子苷能夠有效促進(jìn)慢性低灌注缺血性大鼠各腦區(qū)的Bcl-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)，從而證明梔子苷可以通過(guò)促進(jìn)各腦區(qū)Bcl-2表達(dá)對(duì)缺血性大鼠腦損傷發(fā)揮很好的神經(jīng)保護(hù)作用。

表2 各組大鼠海馬各區(qū)和皮質(zhì)區(qū)Bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元的比較（±s，n=10）

表2 各組大鼠海馬各區(qū)和皮質(zhì)區(qū)Bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元的比較（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型組比較，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01；；與口服給藥組比較，◆表示P＜0.05，◆◆表示P＜0.01

后扣帶回皮質(zhì)區(qū)66.90±2.42▲▲36.38±3.02**◆◆70.05±0.56▲▲66.37±1.27▲▲組別假手術(shù)組模型組口服給藥組安理申對(duì)照組海馬CA1區(qū)65.75±2.80▲▲36.12±1.97**◆◆66.60±1.17▲▲63.63±1.29▲▲◆海馬CA2區(qū)62.57±2.24▲▲◆26.93±1.16**◆◆60.55±1.76*▲▲59.72±1.14**▲▲海馬CA3區(qū)64.07±1.36▲▲29.73±1.50**◆◆64.47±4.20▲▲63.62±4.51▲▲

3.2.2 各組大鼠Bax免疫組化檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表3。

由表3可知：模型組與假手術(shù)相比較，大鼠各腦區(qū)Bax陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)明顯增多，差異均有極顯著性意義（P＜0.01），口服給藥組與模型組相比較，各腦區(qū)Bax陽(yáng)性神經(jīng)元明顯減少，差異均有極顯著性差異（P＜0.01），口服給藥組與安理申對(duì)照組相比較，在扣帶回皮質(zhì)區(qū)略高于安理申組，且差異有顯著性（P＜0.05），其他各腦區(qū)Bax陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目均比安理申組略少，差異均無(wú)顯著性意義（P＞0.05），結(jié)果表明，梔子苷能夠有效抑制慢性低灌注缺血性大鼠各腦區(qū)的Bax免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)，從而證明梔子苷可以通過(guò)抑制各腦區(qū)Bax表達(dá)對(duì)缺血性大鼠腦損傷發(fā)揮很好的神經(jīng)保護(hù)作用。

表3 各組大鼠海馬各區(qū)和皮質(zhì)區(qū)Bax陽(yáng)性神經(jīng)元的比較（±s，n=10）

表3 各組大鼠海馬各區(qū)和皮質(zhì)區(qū)Bax陽(yáng)性神經(jīng)元的比較（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型組比較，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01；與口服給藥組比較，◆表示P＜0.05，◆◆表示P＜0.01

后扣帶回皮質(zhì)區(qū)43.67±1.20▲▲◆◆71.12±5.04**◆◆58.30±1.83**▲▲53.73±10.27*▲▲組別假手術(shù)組模型組口服給藥組安理申對(duì)照組海馬CA1區(qū)28.15±0.96▲▲◆◆48.30±5.45**◆◆34.63±1.86**▲▲35.65±6.33**▲▲海馬CA2區(qū)28.02±2.23▲▲◆◆41.22±1.28**◆◆35.17±1.88**▲▲36.18±1.92**▲▲海馬CA3區(qū)22.47±3.20▲▲◆◆41.73±5.67**◆◆28.27±1.95*▲▲31.13±4.20**▲▲

4 討論

目前可知海馬各段對(duì)缺血易損傷性又有以下順序CA1門(mén)區(qū)＞CA2＞CA3＞齒狀回[7]。海馬CA1區(qū)是海馬結(jié)構(gòu)中與人類(lèi)學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切的功能區(qū)，并對(duì)腦缺血更具有選擇易損傷性[8]。LI等[9]用電鏡、DNA電泳和原位末端標(biāo)記染色3種方法，證實(shí)在局灶性腦缺血時(shí)，神經(jīng)元的凋亡和壞死同時(shí)存在，海馬細(xì)胞出現(xiàn)的凋亡率最大。局灶性腦缺血的實(shí)驗(yàn)在報(bào)刊上屢見(jiàn)不鮮，但是對(duì)慢性的全腦缺血的模型實(shí)驗(yàn)研究較少，尤其是從神經(jīng)元的凋亡角度上的文章更是少之又少。本項(xiàng)目即是對(duì)慢性腦缺血大鼠的神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象進(jìn)行梔子苷藥物的干預(yù)，通過(guò)對(duì)海馬及扣帶回皮質(zhì)區(qū)的TUNEL檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證了，梔子苷溶液口服給藥的方法對(duì)慢性缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)元DNA損傷有保護(hù)和促進(jìn)修復(fù)的作用，從而減輕神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而減少腦缺血性損傷的影響，恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)和功能。

Bcl-2為Bcl-2家族中抑制細(xì)胞凋亡的一種膜結(jié)合蛋白，Bcl-2的亞細(xì)胞定位和主要的凋亡相關(guān)作用已經(jīng)明確，能通過(guò)和Bax結(jié)合形成異二聚體，形成穩(wěn)定的非活躍的凋亡影響結(jié)構(gòu)；Bax則是Bcl-2家族促進(jìn)細(xì)胞凋亡的膜結(jié)合蛋白，與Bcl-2結(jié)構(gòu)上有21%的相似性，Bax是通過(guò)和Bcl-2結(jié)合形成異二聚體，從而抑制Bcl-2的作用，來(lái)加速細(xì)胞的凋亡過(guò)程。近年研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷引起的神經(jīng)元凋亡主要是由線粒體途徑介導(dǎo)的，在凋亡誘導(dǎo)因素作用下，線粒體內(nèi)的Bcl-2和Bax結(jié)合的異二聚體解離并將Bax蛋白釋放到胞漿中，從而引發(fā)下一級(jí)的凋亡進(jìn)程。梔子苷可以明顯改善大鼠缺血性腦神經(jīng)元的凋亡狀況，尤其是在全腦缺血再灌注損傷所造成的海馬區(qū)缺血半暗帶的神經(jīng)元的凋亡[10]，王磊等實(shí)驗(yàn)證明[11]梔子苷能通過(guò)既上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，又下調(diào)凋亡蛋白Bax、轉(zhuǎn)錄因子p53的水平來(lái)治療阿爾茨海默病。而本項(xiàng)目也實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Bcl-2蛋白表達(dá)有抑制凋亡作用，Bax蛋白有促進(jìn)神經(jīng)元凋亡的作用，以及梔子苷具有減輕慢性缺血性腦損傷大鼠大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元的凋亡效果，機(jī)制可能與其促進(jìn)大鼠大腦皮質(zhì)和海馬各區(qū)Bcl-2蛋白的表達(dá)同時(shí)抑制Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)。本項(xiàng)目結(jié)果提示梔子苷在治療慢性腦缺血造成的疾病中有良好而肯定的應(yīng)用前景，值得深入開(kāi)展梔子類(lèi)的中藥新藥的研發(fā)和抗凋亡研究，為探索給藥新途徑，提供了有意義的摸索。我國(guó)梔子藥材資源非常豐富，為梔子類(lèi)的新藥開(kāi)發(fā)提供了資源保障。而梔子作為清開(kāi)靈制劑的主要組成及王永炎院士解毒通絡(luò)方劑[12]的主要藥物，其臨床療效已得到肯定，期待梔子類(lèi)中藥的其它各種吸收良好，效能更強(qiáng)的劑型的出現(xiàn)，豐富治療慢性腦缺血損傷的藥品種類(lèi)。

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