★ 覃倩華 楊萍 李英 李樂(lè)園 袁穎

（上海中醫(yī)藥大學(xué) 上海 201203）

黃芪具有補(bǔ)氣固表、利水退腫、托毒排膿、生肌等功效，當(dāng)歸具有補(bǔ)血調(diào)經(jīng)、活血止痛的功效。黃芪當(dāng)歸配伍，為臨床所常用，廣泛用于免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多種疾病，近來(lái)報(bào)道還可用于慢性肝病，慢性腎病等的治療[1-3]。本項(xiàng)目擬從免疫藥理方面探討黃芪當(dāng)歸藥對(duì)不同配伍比例的作用差異，總結(jié)配伍比例與其作用之間的關(guān)系，為臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 昆明種小鼠，清潔級(jí)，雄性，體重20±2 g，共285只由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005；豚鼠：普通級(jí)，雄性，體重300g，共3只，由上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司提供。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-0007。隨機(jī)分為10組，分別是正常組、模型組、芪歸10：1（高）組、芪歸10：1（低）組、芪歸5：1（高）組、芪歸5：1（低）組、芪歸1：1（高）組、芪歸1：1（低）組、芪歸1：2（高）組、芪歸1：2（低）組。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：12030725。干粉用生理鹽水稀釋，配制成4 mg/mL濃度備用。

黃芪、當(dāng)歸飲片均購(gòu)自上?？禈蝻嬈瑥S。黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch．）Bge.vsr.mongholicus（Bge．）Hsiao.的干燥根，產(chǎn)地：甘肅，批號(hào)：120416；當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸 Angelica sinensis（Oliv．）Diels的干燥根，產(chǎn)地：甘肅，批號(hào)：120109。以上飲片經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定。

中藥水煎劑：黃芪當(dāng)歸藥材按1：2、1：1、10：1、5：1比例分別混合，總量均為300 g，加8倍量水煎煮。水煎2次，每次40 min。煎好后過(guò)濾去渣。將2次煎液混合，濃縮至300 mL。使藥液濃度為1 g（生藥）/mL。

1.1.3 主要試劑 羊血：上海青陽(yáng)試劑有限公司提供。植物血凝素（PHA）：上海疾控生物科技有限公司，批號(hào)：20125301。瑞氏染液：珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：411072。中性樹(shù)膠：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20110321。

綿羊紅細(xì)胞配制方法：取羊血用生理鹽水吹洗，2 000 r/min離心5 min棄去上清，繼續(xù)用生理鹽水吹洗，離心，共3次，棄上清，用生理鹽水稀釋成5%SRBC懸液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

補(bǔ)體配制方法：采集豚鼠血液，分離血清，將1 mL壓積的SRBC加入到5 mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30 min，振蕩，離心，取上清-70℃保存，用時(shí)以生理鹽水按1：10稀釋，備用。

1.1.4 主要儀器 電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司，型號(hào)：AR124CN；離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：KA-1000；電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：DK-600；分光光度計(jì)，德國(guó)生產(chǎn)，型號(hào)：FB12；顯微鏡（油鏡），型號(hào)：OLYMPUS，MODEL：CH20B2MF200。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 除正常組外，各組小鼠于實(shí)驗(yàn)第1、4、9d腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg以建立免疫低下小鼠模型。

1.2.2 給藥方法 除正常組和模型組外，其余各組分別灌胃給予相應(yīng)配比的芪歸水煎液，1次/d，連續(xù)12d。其中高劑量組0.2 mL/10 g（體重），低劑量組0.1 mL/10 g。正常組和模型組灌胃等量的生理鹽水。

1.2.3 黃芪當(dāng)歸藥對(duì)不同配比對(duì)免疫低下小鼠免疫器官重量的影響 于實(shí)驗(yàn)第13d對(duì)所有小鼠稱重，脫頸椎處死，取脾臟和胸腺稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

脾臟指數(shù)（mg/10g）=脾臟重量/體重×104；胸腺指數(shù)（mg/10g）=胸腺重量/體重×104

1.2.4 黃芪當(dāng)歸藥對(duì)不同配比對(duì)免疫低下小鼠血清中溶血素（IgM）的影響 于實(shí)驗(yàn)第8d各組小鼠腹腔注射5%SRBC懸液0.2 mL免疫，第13d摘眼球取血，于室溫靜置2 h，2 000 r/min離心10 min，取血清。將血清稀釋100倍后，取稀釋血清0.5 mL，依次加入5%SRBC 0.5 mL、10%補(bǔ)體0.5 mL、PBS液0.5 mL，混勻，37℃恒溫孵育1 h，立即放入冰水浴終止反應(yīng)。3 000 r/min離心10 min，收集上清液于540 nm處測(cè)OD值，以反映血清中抗SRBC特異性抗體IgM的溶血值（HC）。

HC IgM=經(jīng)處理血清的OD值×100（稀釋倍數(shù)）。

1.2.5 黃芪當(dāng)歸藥對(duì)不同配比對(duì)免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響（體內(nèi)誘導(dǎo)法）于實(shí)驗(yàn)第9d起，各組小鼠每日肌內(nèi)注射PHA 10mg/kg，連續(xù)3d，實(shí)驗(yàn)第13d剪尾，取血，涂片。待片干后，以瑞氏染色液及磷酸鹽緩沖液染色15-20 min，用水沖洗，室溫下晾干。用顯微鏡油鏡觀察血涂片，計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞中淋巴母細(xì)胞和過(guò)渡態(tài)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=100×轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)/（轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)+未轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)）

2 結(jié)果

2.1 黃芪當(dāng)歸藥對(duì)不同配比對(duì)免疫低下小鼠免疫器官重量的影響，見(jiàn)表1。

表1 黃芪當(dāng)歸藥對(duì)不同配比對(duì)免疫低下小鼠免疫器官重量的影響（mg/g±s n=20）

表1 黃芪當(dāng)歸藥對(duì)不同配比對(duì)免疫低下小鼠免疫器官重量的影響（mg/g±s n=20）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01。

胸腺指數(shù)3.25±0.84 2.05±0.49**1.65±0.33 1.60±0.65 2.19±0.71 2.48±0.44 1.73±0.29 1.80±0.38 1.99±0.65 2.00±0.34組別（n）正常對(duì)照組模型組10:1高劑量組10:1低劑量組5:1高劑量組5:1低劑量組1:1高劑量組1:1低劑量組1:2高劑量組1:2低劑量組脾臟指數(shù)2.74±0.42 3.26±1.01 2.84±1.04 2.77±0.78 3.27±1.03 2.40±0.68 2.67±0.80 3.72±1.80 3.08±0.87 2.25±0.54

由表1可知脾臟指數(shù)各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；胸腺指數(shù)：模型組與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 黃芪當(dāng)歸藥對(duì)不同配比對(duì)免疫低下小鼠血清中溶血素（IgM）的影響，見(jiàn)表2。

表2 黃芪當(dāng)歸藥對(duì)不同配比對(duì)免疫低下小鼠血清中溶血素（IgM）的影響（±s n=20）

表2 黃芪當(dāng)歸藥對(duì)不同配比對(duì)免疫低下小鼠血清中溶血素（IgM）的影響（±s n=20）

注：與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

溶血值10.40±1.41 8.31±3.87 22.85±3.30##20.46±1.51##11.94±1.35##23.95±2.69##10.95±1.41#17.72±4.55##6.61±1.86 11.61±2.74##組別（n）正常對(duì)照組模型組10:1高劑量組10:1低劑量組5:1高劑量組5:1低劑量組1:1高劑量組1:1低劑量組1:2高劑量組1:2低劑量組

由表2可知與正常對(duì)照組相比，模型組溶血值有降低趨勢(shì)，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），10：1高劑量組、10：1低劑量組、5：1高劑量組、5：1低劑量組、1：1低劑量組、1：2低劑量組、1：1高劑量組與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 黃芪當(dāng)歸藥對(duì)不同配比對(duì)免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，見(jiàn)表3。

表3 黃芪當(dāng)歸藥對(duì)不同配比對(duì)免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響（±s n=20）

表3 黃芪當(dāng)歸藥對(duì)不同配比對(duì)免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響（±s n=20）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01，與模型組比較，##P＜0.01。

轉(zhuǎn)化率0.50±0.15 0.33±0.08**0.56±0.04##0.58±0.08##0.49±0.09##0.37±0.10 0.56±0.12##0.47±0.10##0.49±0.12##0.41±0.13組別（n）正常對(duì)照組模型組10:1高劑量組10:1低劑量組5:1高劑量組5:1低劑量組1:1高劑量組1:1低劑量組1:2高劑量組1:2低劑量組

由表3可知，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率：模型組與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），10：1高劑量組、10：1低劑量組、5：1高劑量組、1：1高劑量組、1：1低劑量組、1：2高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

黃芪被謄為“補(bǔ)氣之長(zhǎng)”，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。黃芪總黃酮可提高氫化考地松（HC）致免疫功能低下小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞水平，抑制CD8+T細(xì)胞的表達(dá)，升高CD4+／CD8+比值，并升高血清IFN-γ水平，降低IL-4水平[4]。當(dāng)歸多糖組分AP-3對(duì)不同淋巴細(xì)胞亞群的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AP-3能顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、混合淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，而對(duì)B細(xì)胞增殖有一定的抑制作用；顯著增加培養(yǎng)的脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞亞群的比例[5]。黃芪當(dāng)歸配伍臨床應(yīng)用有不同的比例，表現(xiàn)出的治療作用也有所差異。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)應(yīng)用小鼠免疫低下模型，探討黃芪當(dāng)歸不同配伍比例對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用。

環(huán)磷酰胺為氮芥與磷酰胺基結(jié)合而成的化合物，是臨床常用的烷化劑類免疫抑制劑。作為一種烷化類的免疫抑制劑，它可殺傷淋巴細(xì)胞，抑制免疫反應(yīng)[6]。本實(shí)驗(yàn)采用60 mg/kg環(huán)磷酰胺腹腔注射造成小鼠免疫低下模型，觀察體重變化、進(jìn)食量等一般情況和臟器指數(shù)、血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果符合免疫低下表現(xiàn)。

脾臟與胸腺是機(jī)體重要的免疫器官，脾臟與胸腺指數(shù)可以在一定程度上反映機(jī)體的非特異性免疫情況[7]。本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射環(huán)磷酰胺后，小鼠胸腺指數(shù)降低，說(shuō)明存在免疫抑制的情況。各給藥組胸腺、脾指數(shù)與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)于非特異性免疫無(wú)明顯影響。

綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠可使其淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體，并釋放至外周血。檢測(cè)致敏動(dòng)物血清中溶血素的含量，可以反映藥物對(duì)體液免疫的影響[8-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中模型組溶血值有下降趨勢(shì)，但與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，芪歸藥對(duì)配比10：1高、低劑量組，5：1高、低劑量組，1：1高、低劑量組以及1：2低劑量組可促進(jìn)小鼠血清IgM的產(chǎn)生，對(duì)體液免疫有一定促進(jìn)作用。

淋巴細(xì)胞是一種免疫細(xì)胞，可以作為細(xì)胞免疫功能的指標(biāo)，其轉(zhuǎn)化率比正常值高，表明轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)量比正常值高，機(jī)體的細(xì)胞免疫功能比正常機(jī)體的細(xì)胞免疫功能高。因此測(cè)定淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率可以反映出機(jī)體的免疫功能[11-12]。本次實(shí)驗(yàn)中，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率促進(jìn)效果較為明顯的是芪歸藥對(duì)配比10：1高、低劑量組，5：1高劑量組，1：1高、低劑量組和1：2高劑量組，說(shuō)明對(duì)于細(xì)胞免疫有一定促進(jìn)作用。

綜合以上分析，芪歸配比10：1的高、低劑量組，5：1高劑量組，1：1的高、低劑量組對(duì)提高小鼠免疫效果比較顯著，即黃芪當(dāng)歸配伍用于免疫調(diào)節(jié)時(shí)黃芪用量大于或等于當(dāng)歸用量療效較好，這與黃芪可“補(bǔ)氣生血、補(bǔ)氣行血、補(bǔ)氣升陽(yáng)”的中醫(yī)理論相吻合。以后還可從細(xì)胞因子及分子生物學(xué)層面探討黃芪當(dāng)歸藥對(duì)在免疫作用方面的規(guī)律。

[1]姚光弼.臨床肝臟病學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004：457.

[2]王海燕，李驚子，潘緝圣，等.中藥黃芪當(dāng)歸合劑對(duì)腎病綜合征腎損傷的保護(hù)作用及對(duì)代謝紊亂的影響[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2002，32（5）：542-552．

[3]陶艷艷，陳園，陳高峰.當(dāng)歸補(bǔ)血湯的不同配比組方對(duì)肝纖維化的影響[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，22（1）：40-44.

[4]顏培宇，于曉紅，張德山，等.黃芪總黃酮對(duì)免疫功能低下小鼠T細(xì)胞極化的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，32（2）：163-164.

[5]楊鐵虹，賈敏，梅其炳.當(dāng)歸多糖組分AP-3對(duì)不同淋巴細(xì)胞亞群的作用[J].中國(guó)生化藥物雜志，2005，26（6）：344-346.

[6]胡成穆，陳琳，李榮，等.豹皮樟總黃酮對(duì)免疫低下小鼠免疫功能的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23（6）：804-808.

[7]侯安繼，汪暉，高衛(wèi)，等.李時(shí)珍藥酒對(duì)小鼠免疫器官重量和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響[J].醫(yī)學(xué)新知雜志，2002，12（4）：196-197.

[8]周婭紅.人參總皂苷對(duì)免疫低下小鼠免疫功能的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2010，19（9）：1 559-1 561.

[9]徐學(xué)瑛，李元，許津.一個(gè)改進(jìn)的體液免疫測(cè)定方法——溶血素測(cè)定法[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1979，14（7）：443-446.

[10]孟達(dá)理，朱萱萱，劉志輝，等.麻黃多糖對(duì)綿陽(yáng)紅細(xì)胞所致免疫功能低下模型小鼠溶血素抗體生成的影響（比色法）[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2007，21（1）：36-37.

[11]陳德宇，許飏，史丙俊，等.芪加真武湯對(duì)免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及血清白介素2的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2003，2（4）：212-214.

[12]包牧瑩，梁秀宇，田樹(shù)新，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，1（4）：226-229.