吳志剛，沈洪艷* ，高吉喜 ，王勇軍，趙秀梅，尚亞樓

(1.河北科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊050080;2. 國家環(huán)保部 南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京210042;3.華北制藥股份有限公司環(huán)境保護(hù)研究所，河北 石家莊050015;4.華北制藥華勝有限公司，河北 石家莊050021)

抗生素被廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，它們的殘留廣泛存在于水環(huán)境中［1］。這些抗生素促使細(xì)菌種群中產(chǎn)生具有抗藥性基因的新型污染物［2］，并由生物體引起生態(tài)危害，最終對(duì)人類健康產(chǎn)生影響［3-4］。我國是世界上最大的抗生素生產(chǎn)國，青霉素和土霉素的產(chǎn)量居世界第一［5-6］。青霉素和土霉素均采用發(fā)酵法生產(chǎn)，生產(chǎn)過程中會(huì)排放大量廢水。在我國，生產(chǎn)1 t 青霉素和1 t 土霉素的最高允許排水量分別為4.7 t 和1.3 t。按照我國環(huán)保規(guī)定，目前抗生素生產(chǎn)廢水均需要在廠內(nèi)進(jìn)行處理，處理達(dá)標(biāo)后出水排入城市污水處理廠。目前來看，污水處理廠對(duì)抗生素的去除仍不夠徹底［7-9］，使得抗生素類藥物廣泛存在于市政廢水、醫(yī)院廢水、地表水和地下水中［10］。而污水處理廠是抗生素類藥物進(jìn)入環(huán)境的重要點(diǎn)源，因此水環(huán)境中抗生素的最主要來源是污水處理廠的處理廢水。

當(dāng)生物暴露于外源性污染物中時(shí)，污染物能夠參與生物體內(nèi)的氧化還原循環(huán)，并產(chǎn)生大量的活性氧，從而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)。超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)是動(dòng)物抵御活性氧傷害的2 種重要酶類，在清除超氧陰離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)，以及阻止或減少氧自由基方面起著十分重要的作用。正常情況下，機(jī)體自由基的產(chǎn)生和清除基本處于一個(gè)平衡狀態(tài)［11］。當(dāng)自由基含量增加，會(huì)引發(fā)機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成醛基(MDA)等新的氧化自由基，對(duì)生物體造成損傷。近年來國內(nèi)外在抗生素對(duì)生物的影響方面已開展了廣泛研究，尤其是抗生素在水生生態(tài)系統(tǒng)方面的研究報(bào)道不斷增多［12］，但有關(guān)抗生素生產(chǎn)廢水出水對(duì)水生生物魚類影響的報(bào)道還不多。

本實(shí)驗(yàn)選取了具有代表性的含青霉素和土霉素2 種抗生素的混合廢水在廠內(nèi)污水處理廠處理后的二沉池出水，以錦鯉(Cyprinus carpio)為研究對(duì)象，探討青霉素和土霉素混合廢水出水對(duì)魚體內(nèi)抗氧化酶系中SOD、CAT 活性及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 含量產(chǎn)生的影響，為進(jìn)一步研究青霉素和土霉素在環(huán)境中的生態(tài)效應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 水樣 本實(shí)驗(yàn)水樣取自某藥廠污水處理廠青霉素和土霉素混合廢水經(jīng)處理后的二沉池出水。水樣經(jīng)分析測(cè)試中心檢測(cè)，水樣中含有土霉素(0.4 g/L)、青霉素(162 ug/L)、丁醇(1 ng/L)和乙酸丁酯(5 ng/L)。丁醇和乙酸丁酯是抗生素生產(chǎn)過程中的溶媒，2 種溶媒體沒有毒性。

1.1.2 儀器和試劑 UV-2550 型紫外可見分光光度計(jì);DK-S26 型恒溫水浴鍋;微量移液器若干;TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī);SYZ-A 型石英亞沸高純水蒸餾器;XK96-B 型快速混勻器;玻璃組織勻漿器若干;JPBJ—608 型便攜式溶解氧測(cè)定儀;EL204 型電子分析天平;FE20 型pH 計(jì);微型溫度計(jì)和水硬度計(jì)(WAD-TH)等。SOD、CAT、MDA 和考馬斯亮蘭試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所。

1.1.3 受試生物 選用錦鯉(Cyprinus carpio)為受試生物，由石家莊水產(chǎn)養(yǎng)殖基地提供，體長為(38.12±0.22)mm，體重為(1.72 ±0.28)g，魚苗經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%食鹽水消毒后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，用48 h 曝氣的脫氯自來水在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)7 d 用于試驗(yàn)，試驗(yàn)水質(zhì)符合漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，馴養(yǎng)期間錦鯉死亡率＜5%。

1.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)青、土霉素混合廢水出水對(duì)錦鯉急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(96 h LC50=12.94%)即φ(96 h LC50)進(jìn)行亞急性毒性濃度組設(shè)置，設(shè)置暴露濃度分別為1/4 φ(96 h LC50)、1/16 φ(96 h LC50)和1/256 φ(96 h LC50)，暴露10 d。

將在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)馴養(yǎng)7 d 的試驗(yàn)魚，隨機(jī)放入暴露組和空白對(duì)照組，同時(shí)每一濃度組設(shè)置3 個(gè)平行，試驗(yàn)液用48 h 脫氯自來水進(jìn)行稀釋。在25 L 水族箱中分別加入20 L 試驗(yàn)溶液，每組投20 尾錦鯉，每2 d 測(cè)1 次MDA 含量和SOD、CAT 活性指標(biāo)。

取樣及樣品前處理:每次從相應(yīng)的濃度組中取3 條試驗(yàn)魚，解剖，取其肝臟組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱取組織重量后，放入玻璃勻漿管中;用移液器按1∶9 重量體積比(W/V)量取預(yù)冷生理鹽水，加入到勻漿管中進(jìn)行勻漿，勻漿過程在冰水浴中進(jìn)行，充分研磨約8 min，制得10%的組織勻漿;將制備好的勻漿液用普通離心機(jī)在3 000 r/min 下離心10 min，取其上清液保存于4 ℃冰箱中。

測(cè)定方法:SOD、CAT 活性和MDA 含量按試劑盒提供的方法進(jìn)行測(cè)定。SOD 采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，其活性單位定義為:在30 ℃條件下，每毫克組織蛋白在1 mL 反應(yīng)液中SOD 抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD 量為一個(gè)SOD 活力單位(U)。CAT 采用可見光法測(cè)定，以每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol 的H2O2量為一個(gè)酶活力單位(U)。MDA 測(cè)定采用硫代巴比妥酸反應(yīng)(TBA)比色法，其單位為nmol/(mg·prot)。蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮蘭法。

實(shí)驗(yàn)條件:每次實(shí)驗(yàn)前到該藥廠取水，以保證水的新鮮。試驗(yàn)用水pH 值為7 ～9;總硬度約為100 mg/L;試驗(yàn)溫度為22 ～24 ℃;溶解氧不低于5 mg/L。暴露期間每日喂1 次魚食，但為防止餌料的影響，測(cè)試指標(biāo)的前1 天不喂食。試驗(yàn)期間用曝氣裝置連續(xù)曝氣，每天更新1 次溶液，每天至少測(cè)定1次試驗(yàn)溶液的水溫、硬度、pH 值、溶解氧含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)。本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS15.0 統(tǒng)計(jì)軟件和ANOVA 法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性顯著分析，0.01 ＜P ＜0.05，表示差異顯著;P ＜0.01，表示差異極顯著。

圖1 青、土霉素混合廢水出水對(duì)錦鯉肝臟SOD 活性的影響(與同一天對(duì)照組比較:* 0.01 ＜P ＜0.05，差異顯著;＊＊P ＜0.01，差異極顯著)Fig.1 Effects of mixed wastewater effluent of penicillin and oxytetracycline on SOD activities in liver of Cyprinus carpio(compared with the control group in the same day * 0.01 ＜P ＜0.05 significantly different from control group;＊＊P ＜0.01 more significantly different from control group)

2 結(jié)果與討論

2.1 青、土霉素混合廢水出水對(duì)錦鯉肝臟SOD 活性的影響

SOD 是最先與細(xì)胞中產(chǎn)生的活性氧自由基發(fā)生作用的酶［13］，可將O2-歧化分解為H2O2和O2-，由此構(gòu)成了機(jī)體防御活性氧自由基損傷的第一道防線［14］。從圖1 可以看出，暴露初期(2 d)，含外源污染物(青霉素、土霉素)的1/256、1/16 φ(96 h LC50)濃度組混合廢水出水對(duì)錦鯉肝臟產(chǎn)生了輕微刺激，使SOD 活性有輕微的升高;而1/4 φ(96 h LC50)濃度組SOD 活性卻出現(xiàn)了抑制的情況，這說明了在外源污染物的刺激下低濃度組魚體內(nèi)SOD 活性均表現(xiàn)出代謝性增強(qiáng)，以清除機(jī)體自由基，高濃度組機(jī)體中自由基已經(jīng)對(duì)細(xì)胞造成損傷，而引起SOD 活性下降。隨著時(shí)間的延長(2 ～6 d)，各濃度組SOD 活性表現(xiàn)不同程度的誘導(dǎo)或抑制現(xiàn)象，且與對(duì)照組比較相差不大(P ＞0.05)，此時(shí)魚體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)的酶促反應(yīng)和活性氧清除之間可能存在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到8 d 時(shí)，各濃度組SOD 活性均高于對(duì)照組，1/16 φ(96 h LC50)濃度組SOD 活性達(dá)到了整個(gè)實(shí)驗(yàn)的最大值［138 U/(mg·prot)］，與對(duì)照組比較差異顯著(0.01 ＜P ＜0.05)。這可能是實(shí)驗(yàn)后期進(jìn)入魚體內(nèi)的抗生素濃度達(dá)到一定程度，使魚體內(nèi)活性氧累積超過正常水平，SOD 由于底物濃度升高而加速SOD 合成。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?10 d)各濃度組SOD 活性均降低至對(duì)照組水平。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，青、土霉素混合廢水出水對(duì)錦鯉肝臟SOD 活性變化影響不大。

2.2 青、土霉素混合廢水出水對(duì)錦鯉肝臟CAT 活性的影響

CAT 是存在生物體內(nèi)的非常重要的抗氧化防御性功能酶，可與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH - Px)等一起，清除H2O2，減輕自由基對(duì)生物體的氧化損傷，因而其在生物體的抗氧化防御系統(tǒng)中占有非常重要地位［15］。在H2O2濃度低的情況下，組織中的過氧化物主要由GSH-Px 來催化，在H2O2濃度高的情況下，則由CAT 來催化。有研究表明淡水魚類肝臟CAT 酶的變化對(duì)外源化合物很敏感［16］。圖2 顯示，青、土霉素混合廢水出水對(duì)錦鯉肝臟CAT 活性影響較為顯著，各濃度組CAT 活性均受到不同程度的影響。暴露初期(2 d)，各濃度組CAT 活性開始激活，1/16、1/256 φ(96 h LC50)濃度組CAT 活性顯著高于對(duì)照組(P ＜0.05)，這可能是由于SOD的誘導(dǎo)使得H2O2在魚體內(nèi)不斷積累，引起CAT 活性激活。4 d 時(shí)1/16、1/256 φ(96 h LC50)濃度組CAT 活性突然下降，且1/256 φ(96 h LC50)濃度組CAT 活性受到顯著抑制(0.01 ＜P ＜0.05)，這可能是因?yàn)榈蜐舛冉M中魚體內(nèi)H2O2的濃度過低，組織中的過氧化物主要由GSH-Px 來催化，此時(shí)機(jī)體內(nèi)GSH-Px 活性很高，CAT 活性很低;1/4 φ(96 h LC50)濃度組中魚體內(nèi)H2O2累積達(dá)到一定程度，而引起CAT活性受到大量誘導(dǎo)(P ＜0.01)。暴露中期(6 d)，1/16、1/4 φ(96 h LC50)濃度組CAT 活性降至對(duì)照組水平，這很可能是高濃度組魚體內(nèi)的抗生素(土霉素)濃度達(dá)到一定程度而發(fā)生了作用。因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類藥物具有清除抗氧自由基的作用，可以使氧自由基減少［17］，從而使機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)恢復(fù)平衡狀態(tài)。8 d 時(shí)，1/4 φ(96 h LC50)濃度組CAT 活性突然激活，激活率達(dá)到了62.5%，此時(shí)魚體肝臟細(xì)胞內(nèi)H2O2累積量達(dá)到最大，但仍未對(duì)肝臟造成損傷。10 d 時(shí)，1/4 φ(96 h LC50)濃度組CAT 活性突然受到顯著抑制(0.01 ＜P ＜0.05)，這是由于實(shí)驗(yàn)后期CAT 代謝H2O2能力達(dá)到飽和，H2O2在魚體細(xì)胞內(nèi)的積累量已促使CAT 產(chǎn)生中毒反應(yīng)，故CAT 活性大幅度降低，這也有可能是暴露后期魚體內(nèi)抗生素濃度過高，導(dǎo)致了抗氧化酶在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)酶受損，使得其清除活性氧的功能喪失。1/16 φ(96 h LC50)濃度組CAT 活性受到顯著誘導(dǎo)(0.01 ＜P ＜0.05)，魚體內(nèi)肝臟組織已受到明顯的氧化損傷;1/256 φ(96 h LC50)濃度組上升至對(duì)照組水平，此時(shí)機(jī)體內(nèi)活性氧的代謝已趨于平衡。整個(gè)暴露期間，1/4 φ(96 h LC50)濃度組CAT 活性表現(xiàn)出雙峰型的變化趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在4 d 和8 d。1/16、1/256 φ(96 h LC50)濃度組CAT 活性呈相似的“上升-下降-上升”的周期性波動(dòng)規(guī)律，有研究表明機(jī)體抗氧化酶活性的變化(升高或降低)表示機(jī)體內(nèi)活性氧的大量增加，并已擾亂機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的正常功能［18］，本實(shí)驗(yàn)中各濃度組CAT 酶活性的反復(fù)變化證實(shí)了暴露期間魚肝細(xì)胞已經(jīng)受到了氧化損傷。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在青、土霉素混合廢水出水暴露下，魚體CAT 活性產(chǎn)生較大變化，說明青、土霉素混合廢水出水暴露可引起魚體產(chǎn)生較強(qiáng)的氧化壓力。

圖2 青、土霉素混合廢水出水對(duì)錦鯉肝臟CAT 活性的影響(與同一天對(duì)照組比較:* 0.01 ＜P ＜0.05，差異顯著;＊＊P ＜0.01，差異極顯著)Fig.2 Effects of mixed wastewater effluent of penicillin and oxytetracycline on CAT activities in liver of Cyprinus carpio(compared with the control group in the same day * 0.01 ＜P ＜0.05 significantly different from control group;＊＊P ＜0.01 more significantly different from control group)

2.3 青、土霉素混合廢水出水對(duì)錦鯉肝臟MDA 含量的影響

MDA 作為氧化損傷最終形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量可間接提示機(jī)體自由基水平，是毒性作用和保護(hù)作用的綜合反映［19］。圖3 顯示，暴露初期，只有1/4 φ(96 h LC50)濃度組MDA 含量顯著高于對(duì)照組(0.01 ＜P ＜0.05)，由于此時(shí)機(jī)體抗氧化酶調(diào)節(jié)能力有限，魚體在短期內(nèi)積累了過量的氧自由基而引起膜的過氧化，使MDA 含量上升。4 d時(shí)，各濃度組MDA 含量均有所上升，1/4 φ(96 h LC50)濃度組與對(duì)照組相比差異極顯著(P ＜0. 01)，這是因?yàn)闄C(jī)體CAT 活性的大量誘導(dǎo)并不能完全清除體內(nèi)過量的H2O2，也有可能是由于H2O2還存在其它來源(如從氨基酸或細(xì)胞色素P450 氧化酶激活產(chǎn)生［20］)，從而導(dǎo)致H2O2的過量累積對(duì)機(jī)體產(chǎn)生明顯損傷，使MDA 含量明顯升高，這也說明了機(jī)體的氧化損傷仍在進(jìn)一步加深;1/256 φ(96 h LC50)濃度組MDA 含量顯著上升(0.01 ＜P ＜0.05)，說明機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶系已經(jīng)遭到破壞，機(jī)體開始受到活性氧的攻擊。6 d 時(shí)，1/4、1/16 φ(96 h LC50)濃度組MDA 含量突然低于對(duì)照組水平(P ＞0.05)，很可能是由于此時(shí)高濃度組中魚內(nèi)的土霉素發(fā)生了清除氧自由基作用，魚體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)，MDA 含量趨于平緩;此時(shí)1/256 φ(96 h LC50)濃度組魚體內(nèi)的H2O2濃度較4 d 時(shí)已經(jīng)大幅度升高，且已經(jīng)達(dá)到一個(gè)閾值，造成機(jī)體嚴(yán)重的氧化損傷，MDA 含量達(dá)到了最大值(41.8 nmol/mgprot)。隨著時(shí)間的延長，1/256 φ(96 h LC50)濃度組MDA 含量不斷下降，10 d 時(shí)機(jī)體氧化損傷得到明顯減輕，其原因可能是實(shí)驗(yàn)后期魚體內(nèi)的土霉素濃度不斷升高，不斷發(fā)生清除自由基作用。1/4 φ(96 h LC50)濃度組在10 d 時(shí)MDA 含量達(dá)到了整個(gè)實(shí)驗(yàn)的最高峰(P ＜0.01)，1/16 φ(96 h LC50)濃度組MDA 含量也開始顯著高于對(duì)照組(0.01 ＜P ＜0.05);這有可能是由于在實(shí)驗(yàn)后期進(jìn)入魚體內(nèi)的抗生素濃度過高，已經(jīng)超出了土霉素清除自由基的濃度范圍，開始對(duì)魚體細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，使得MDA 含量有所增加。也有研究表明，土霉素不同于其他持久性有機(jī)污染物，長期在高濃度暴露下最終會(huì)對(duì)各種抗氧化酶產(chǎn)生毒害，從而導(dǎo)致各種酶活性降低和氧化損傷出現(xiàn)［21］。由此可以推測(cè)，還可能是由于魚體內(nèi)高濃度的土霉素直接對(duì)機(jī)體的抗氧化酶產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致氧化損傷再次出現(xiàn)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，1/256 φ(96 h LC50)濃度組MDA 含量呈現(xiàn)出單峰型變化趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在6 d。1/16、1/4 φ(96 h LC50)濃度組MDA 含量隨暴露時(shí)間的延長均呈現(xiàn)“上升-平緩-上升”的趨勢(shì)，吳爾苗等［22］在研究菲和芘對(duì)蚯蚓MDA 含量的毒性實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了相似的規(guī)律。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青、土霉素混合廢水出水對(duì)錦鯉肝臟MDA 影響顯著，暴露初期(2 d)和暴露末期(10 d)各濃度組MDA 含量表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，暴露濃度越大，機(jī)體受到的氧化損傷越明顯。

圖3 青、土霉素混合廢水出水對(duì)錦鯉肝臟MDA 含量的影響(與同一天對(duì)照組比較:* 0.01 ＜P ＜0.05，差異顯著;＊＊P ＜0.01，差異極顯著)Fig.3 Effects of mixed wastewater effluent of penicillin and oxytetracycline on MDA content in liver of Cyprinus carpio(compared with the control group in the same day * 0.01 ＜P ＜0.05 significantly different from control group;＊＊P ＜0.01 more significantly different from control group)

3 結(jié)論

整個(gè)暴露期間，青、土霉素混合廢水出水對(duì)錦鯉肝臟SOD 活性變化影響不大，對(duì)CAT 活性和MDA含量影響較為顯著。1/16、1/256 φ(96 h LC50)濃度組CAT 活性呈相似的“上升-下降-上升”的周期性波動(dòng)規(guī)律，1/4 φ(96 h LC50)濃度組CAT 活性表現(xiàn)出雙峰型變化趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在4 d 和8 d。1/256 φ(96 h LC50)濃度組MDA 含量呈現(xiàn)出單峰型變化趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在6 d;1/16、1/4 φ(96 h LC50)濃度組MDA 含量隨暴露時(shí)間的延長呈現(xiàn)“上升-平緩-上升”的趨勢(shì)。

在青、土霉素混合廢水出水暴露下，魚體CAT 活性產(chǎn)生較大變化，引起了魚體產(chǎn)生較強(qiáng)的氧化壓力;SOD 活性只在個(gè)別濃度和個(gè)別時(shí)間段下才出現(xiàn)顯著誘導(dǎo)。SOD、CAT 活性的變化也反映了青、土霉素混合廢水出水對(duì)魚類抗氧化酶活性的影響模式比較復(fù)雜，因此還需要進(jìn)一步的深入研究。

暴露實(shí)驗(yàn)中，各濃度組魚體肝臟組織均出現(xiàn)不同程度的氧化損傷，當(dāng)魚體內(nèi)的抗生素濃度達(dá)到一定程度時(shí)，機(jī)體氧化損傷得到明顯減輕，這很可能說明了混合廢水出水中的抗生素(土霉素)在較高濃度條件下能夠減緩機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度，而當(dāng)機(jī)體土霉素濃度超出了其清除自由基的范圍時(shí)，機(jī)體再次出現(xiàn)明顯的氧化損傷。錦鯉肝臟中CAT 和MDA 對(duì)青、土霉素混合廢水出水暴露都較為敏感，反映了廢水中抗生素對(duì)魚體肝細(xì)胞的損傷，較好的反映了環(huán)境中氧化脅迫的存在，因此可以考慮作為水環(huán)境中青、土霉素污染監(jiān)測(cè)的水生生物指標(biāo)。

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