張 帥，孟嘯寅，卓勝楠，崔志英，崔險(xiǎn)峰，張?jiān)粕?/p>

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2.天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，天津 300100）

近年來，不育癥的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)。我國(guó)目前的患病率約為10%～15%，其中50%是由男方因素引起的。精液常規(guī)分析是尋找男性不育原因的第一步檢查，主要包括精子密度、精子數(shù)量、前向運(yùn)動(dòng)力和精子形態(tài)學(xué)檢查等，然而這些檢查只反映睪丸的生精功能，不能反映精子DNA損傷和斷裂的情況。因此，上述檢查指標(biāo)不能作為評(píng)估男性生育力的唯一指標(biāo)，況且約有15%的男性不育患者精液檢查是正常的[1]。由此看來，精液常規(guī)分析已經(jīng)不能作為評(píng)估男性生育力的最佳指標(biāo)，而有必要探討新的男性不育評(píng)價(jià)指標(biāo)。現(xiàn)在隨著輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive techniques,ART）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步發(fā)展，對(duì)精子DNA 損傷和碎片化檢測(cè)分析成為近幾年的研究熱點(diǎn)，可以說，它不僅作為一種對(duì)傳統(tǒng)精液常規(guī)檢測(cè)的補(bǔ)充，而且有利于臨床醫(yī)生對(duì)男性生育能力評(píng)估工作的進(jìn)一步完善。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對(duì)象 2012年3月-7月就診于天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心符合納入標(biāo)準(zhǔn)的139例體外受精-胚胎移植助孕初篩患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：常規(guī)體外受精（IVF），新鮮精液標(biāo)本，夫婦染色體G 顯帶技術(shù)檢查均為正常核型，男性檢查包括男性第二性征、陰莖、陰囊、精索、輸精管、附睪、睪丸等均無異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：重度少弱精子癥患者。由于6例因各種臨床因素取消移植，共計(jì)133例進(jìn)入胚胎移植（ET）周期，平均年齡（30.1±3.9）歲，平均不育年限（5.1±2.8）年。

1.1.2 儀器和試劑 計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀為北京清華同方（CASAS-QH-Ⅲ）產(chǎn)品；精子DNA 碎片檢測(cè)試劑盒為深圳博銳德生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 精液優(yōu)化分離及精液常規(guī)分析 精液標(biāo)本采集時(shí)間：IVF 取卵日前最后一次排精，禁欲2～7 d，手淫法收集新鮮精液于取精杯內(nèi)，立即放于37℃恒溫箱內(nèi)，完全液化后充分混勻；上泳法處理精液用人輸卵管液（HTF）按照WHO 標(biāo)準(zhǔn)配制[2]，將制備后精液均分為兩份，一份按照WHO 標(biāo)準(zhǔn)行精液常規(guī)分析；采用蘇木素-伊紅染色；按照Kruger（1999）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)行精子形態(tài)學(xué)分析；另一份用配制HTF 調(diào)精子濃度[（5～10）×106/mL]用于精子DNA 碎片檢測(cè)，并根據(jù)DFI 值將上述患者分為A組（DFI＜17.6%）、B組（17.6%≤DFI≤30%）、C組（DFI＞30%）。

1.2.2 精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（1）制片：①易熔凝膠管于80℃孵育20 min，融化后置于37℃待用（平衡5 min）；②生理鹽水調(diào)精子濃度（5～10）×106/mL；取稀釋后標(biāo)本60μL，加入熔化易熔凝膠管（37℃保溫），混勻，37℃孵育待用；③制備精子懸液30μL加入載玻片包被區(qū)，蓋上蓋玻片，置2～8℃冰箱5 min；④小心移去蓋玻片；⑤載玻片垂直浸入反應(yīng)液M（0.09%的H2O2醋酸溶液）反應(yīng)池內(nèi)，20～28℃反應(yīng)7 min；⑥將載玻片浸入反應(yīng)液N（0.5% SDSTris-HCl 緩沖液）反應(yīng)池內(nèi)，20～28℃反應(yīng)25 min；⑦載玻片水平浸入大量純化水中5 min；⑧將載玻片依次浸入70%、90%、100%乙醇反應(yīng)池，2 min；⑨自然干燥。（2）染色：載玻片以瑞氏染液（0.2%瑞氏色素、0.06%吉氏色素甲醇溶液）15～20 滴覆蓋，片刻再加入瑞氏緩沖液（pH 值6.4～ 6.8，0.06 mol/L磷酸鹽緩沖液）30～40 滴，以洗耳球吹打混合染液，室溫15 min 后流水沖洗染片；自然干燥。（3）結(jié)果判斷：在普通光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)精子，根據(jù)Fernández 標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：a.大光暈，暈輪≥精子頭橫徑；b.中光暈：介于大小光暈之間；c.小光暈：暈輪≤精子頭橫徑1/3；d.無光暈；e.退化精子。大光暈、中光暈精子為DNA 完整精子，小光暈、無光暈和退化精子為DNA 損傷精子。

1.2.3 控制性超促排卵及IVF-ET（體外受精-胚胎移植）按常規(guī)GnRH-a 長(zhǎng)方案進(jìn)行，即從前一月經(jīng)周期第21 日起皮下注射GnRH-a 行降調(diào)節(jié)，達(dá)降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后，同時(shí)加用促性腺激素（Gn）誘導(dǎo)卵泡發(fā)育，當(dāng)3個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm 時(shí)，停用GnRH-a 和Gn，根據(jù)患者具體情況當(dāng)晚肌注HCG 4 000～10 000 IU 不等，36 h 后在陰道B 超引導(dǎo)下行穿刺取卵術(shù)。取卵當(dāng)日采用常規(guī)IVF 方法授精，授精后16～18 h 觀察受精情況。授精42 h 和72 h 觀察卵裂情況。見2個(gè)原核（PN）和第2 極體（Pb2）為正常受精，見≥3個(gè)PN 或≤1個(gè)PN為異常受精。根據(jù)改良的Dale 方法對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)級(jí)，將胚胎分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)，Ⅰ～Ⅲ級(jí)胚胎為可移植胚胎，Ⅳ級(jí)胚胎為不可移植胚胎。采卵后72 h 移植1～3個(gè)胚胎，黃體支持采用黃體酮60 mg/d 肌肉注射，剩余有發(fā)育潛能的胚胎行冷凍保存。

1.2.4 觀察指標(biāo)計(jì)算 精子DFI=[（小光暈精子+無光暈精子+退化精子）/500]×100%；IVF 受精率=受精胚胎數(shù)/獲卵數(shù)×100%；卵裂率=2PN 卵裂數(shù)/IVF受精數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN 卵裂數(shù)×100%；ET 后14 d 測(cè)定血清β-hcG≥25 mIU/mL確定為生化妊娠，28 d 后B 超檢查宮腔內(nèi)見妊娠囊確定為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)符合近似正態(tài)分布者以±s 表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩組比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；偏態(tài)分布者以M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)；生化妊娠數(shù)、臨床妊娠數(shù)的比較采用四格表χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組患者一般資料和部分精液常規(guī)參數(shù)比較 共計(jì)133例患者進(jìn)入ET周期，其中A組33例，B組66例，C組34例。與A組比較,B組和C組正常形態(tài)精子率、精子前向活動(dòng)力[（a+b）%]均降低，A、C組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），A、B組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與B組比較，C組正常形態(tài)精子率、精子前向活動(dòng)力[（a+b）%]降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。3組患者的不育時(shí)間、禁欲天數(shù)、精液體積、精子濃度、圓形細(xì)胞數(shù)等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 A、B、C 3組一般資料及部分精液常規(guī)參數(shù)的比較（±s）Tab 1 Comparison of basic data and partial of conventional semen parameters in group A,B,and C（±s）

表1 A、B、C 3組一般資料及部分精液常規(guī)參數(shù)的比較（±s）Tab 1 Comparison of basic data and partial of conventional semen parameters in group A,B,and C（±s）

與A組相比*P<0.05；與B組相比#P<0.05

2.2 3 組患者IVF 受精結(jié)局的比較 與A組比較，B組和C組受精率均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與B組比較，C組受精率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與A組比較，B組和C組卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率降低，A、C組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），A、B組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與B組比較，C組卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；A、B、C 3組間生化妊娠率、臨床妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 A、B、C 3組受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、生化妊娠率、臨床妊娠率的比較（±s,%）Tab 2 Comparison of fertilization rate,cleavage rate,high quality embryos rate,biochemical pregnancy rate and clinical pregnancy rate in group A,B,and C（±s,%）

表2 A、B、C 3組受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、生化妊娠率、臨床妊娠率的比較（±s,%）Tab 2 Comparison of fertilization rate,cleavage rate,high quality embryos rate,biochemical pregnancy rate and clinical pregnancy rate in group A,B,and C（±s,%）

與A組相比*P<0.05；與B組相比#P<0.05

3 討論

目前對(duì)于精子DNA 碎片化是否影響受精率、胚胎發(fā)育及臨床妊娠率等尚存爭(zhēng)議[3]。Jiang 等[4]采用吖啶橙染色法（acridine orange staining technique,AOT）對(duì)116例接受IVF 男性精子進(jìn)行DFI 檢測(cè)，并根據(jù)DFI 值分為DFI≤30%組和DFI＞30%組，結(jié)果顯示兩組之間受精率、卵裂率并無明顯差別。而Bungum 等[5]報(bào)道指出男性精子DFI 如果在30%以上，其獲得正常妊娠的可能性將會(huì)顯著降低。上述研究人員得出不同結(jié)論的原因可能是他們大都是對(duì)精漿原液（包括形態(tài)正常、異常精子和凋亡精子、圓形細(xì)胞等）行DFI 檢測(cè)分析，并非對(duì)形態(tài)正常精子進(jìn)行DFI 檢測(cè)，如果對(duì)精液先行上泳法處理，再行DFI 檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果則與真實(shí)DFI 水平更為接近[6]。而在2011年，Dugum 等[7]在發(fā)表于美國(guó)Journal of Andrology 的一篇綜述中指出，SCD 是一種新的精子DFI 檢測(cè)方法，它不僅特異度較高，而且具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，所以易于在臨床上開展應(yīng)用。本研究中，筆者采用SCD 法對(duì)139例接受IVF 的男性精子進(jìn)行DFI 檢測(cè)，133例進(jìn)入ET周期（因各種臨床因素取消移植6例），并根據(jù)Avenda?o和Jiang 等DFI 分組標(biāo)準(zhǔn)分為A（DFI<17.6%）、B（17.6≤DFI≤30%）、C（DFI>30%）3組，通過研究各組受精率、卵裂率、優(yōu)胚率和妊娠結(jié)局的差異，評(píng)價(jià)精子DFI 檢測(cè)對(duì)IVF-ET 結(jié)局的影響。

本研究顯示，隨著DFI 的升高，A、B、C 3組精子前向活動(dòng)力和正常形態(tài)精子率依次降低，且C組與A、B 兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與Abad 等[8]研究結(jié)論相一致，即他們認(rèn)為弱畸形精子癥患者精液中通常具有較高水平的活性氧類物質(zhì)（reactive oxygen species,ROS），之所以精子DFI 與精子活力、形態(tài)表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性，可能與兩者均是精液ROS 的潛在氧化攻擊對(duì)象有關(guān)，即精液中ROS 達(dá)到一定濃度時(shí)，可同時(shí)引起精子DNA 和膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。另外，國(guó)內(nèi)萬艷等研究認(rèn)為，還可能與精子DNA 損傷導(dǎo)致編碼Na+-K+-ATP 酶的基因發(fā)生改變、ATP酶變性，水解反應(yīng)釋放能量障礙有關(guān)。同時(shí)，Makhlouf 等[9]認(rèn)為，精子細(xì)胞核內(nèi)DFI 的含量經(jīng)歷一個(gè)由少到多的過程，即DFI 含量較少時(shí)，精子DNA 損傷斷裂的區(qū)域主要為非蛋白編碼區(qū)，此時(shí)并不會(huì)引起精子功能的明顯下降，如果精子DNA 損傷的斷鏈不能被及時(shí)修復(fù)，精漿中有害因素（如ROS）就會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致精子DNA 的蛋白編碼區(qū)基因受到破壞，從而導(dǎo)致不同程度的精子功能缺陷。Bj觟rndahl 等[10]認(rèn)為，精子染色質(zhì)中DFI 會(huì)導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的顯著降低，并可能引起IVF 受精過程中雄性原核形成受阻而導(dǎo)致IVF 受精率降低。另外，Kato 等[11]認(rèn)為如果精子表達(dá)微管的基因受損時(shí)則會(huì)導(dǎo)致受精卵卵裂停滯、卵裂率降低，甚至?xí)古咛ニ槠瑪?shù)量增多而影響胚胎質(zhì)量。本研究顯示，隨著DFI值的升高，A、B、C 3組IVF 受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率呈逐漸下降趨勢(shì)，且C組與A、B 兩組間的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與Avenda?o 等研究結(jié)論相一致，即精子DFI 與其受精能力、胚胎卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率之間呈負(fù)相關(guān)性。

另一方面，本研究并未得出與Avenda?o 等完全一致的結(jié)論，即未顯示A，B，C 3組間生化妊娠率、臨床妊娠率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本研究樣本例數(shù)不夠大有關(guān)。其次也可能與DFI 對(duì)精子受精能力、胚胎分裂功能的影響要遠(yuǎn)大于受精后胚胎植入及妊娠結(jié)局的后續(xù)影響等有關(guān)。應(yīng)該注意的是，胚胎植入母體子宮內(nèi)膜后能否正常生長(zhǎng)發(fā)育取決于諸多因素，例如，母-胎之間的免疫耐受狀態(tài)、血液營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、環(huán)境暴露、母體情緒應(yīng)激變化等，所以筆者的研究結(jié)果沒有顯示出精子DFI 與生化妊娠率、臨床妊娠率的相關(guān)性。

綜上所述，筆者的研究顯示，精子DFI 影響精子活力和IVF 結(jié)局，尤其當(dāng)DFI＞30%時(shí)會(huì)導(dǎo)致IVF受精率、卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著降低。因此，對(duì)精液常規(guī)檢查正常的男性不育患者進(jìn)行精子DFI 檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)男性不育的治療有一定的臨床意義。

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