內(nèi)蒙古 張金寶 白寶霞

扎蘭屯地區(qū)雞大腸桿菌病病原分離鑒定

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本文從扎蘭屯地區(qū)發(fā)病雞群中分離出致病性大腸桿菌18株，分離率為90%，對18株菌進(jìn)行了血清型鑒定，鑒定出6種不同的血清型，分別為O78、O2、O88、O57、O100和O35。其中O78、O2、O57是主要血清型，占定型總數(shù)的66.67%。

雞；大腸桿菌??；病原分離鑒定

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

扎蘭屯地區(qū)6個不同的雞場疑似大腸桿菌病的30只病、死雞。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥康凱瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、普通肉湯培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨、伊紅美藍(lán)瓊脂、瓊脂粉等試劑、MH營養(yǎng)瓊脂，由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 革蘭氏染色液

購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.4 微量生化發(fā)酵管

腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管GYZ-15E，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.5 實驗動物

95只雛雞，購自扎蘭屯種雞場。

1.1.6 大腸桿菌“O”型抗原標(biāo)準(zhǔn)血清

購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.7 標(biāo)準(zhǔn)菌株

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng)

無菌采取病死雞心血、肝臟、脾臟，分別接種于普通肉湯、麥康凱瓊脂和伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，挑選麥康凱瓊脂平板上磚紅色菌落接種營養(yǎng)瓊脂斜面進(jìn)行純培養(yǎng)，培養(yǎng)后膠塞密封，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r另挑選單個菌落涂片革蘭氏染色，進(jìn)行菌體形態(tài)和染色特征的觀察。

1.1.2 生化試驗

用接種針在培養(yǎng)基上挑取單個菌落，接種于生化管中，置于溫箱中37℃培養(yǎng)36h后觀察結(jié)果。

1.2.3 血清型鑒定

將分離符合大腸桿菌特性的純培養(yǎng)物接種于普通瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24h，用滅菌的生理鹽水5-6 ml沖洗，洗下菌苔，置于滅菌的西林瓶中，封口后，經(jīng)121℃高壓2h，破壞其K抗原，得菌體抗原(即O抗原)，置于4℃冰箱中。用大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)O抗原對18株分離菌株在玻片上做凝集試驗，用接種環(huán)取一環(huán)高壓抗原（0.05ml）涂于玻片上，再取一環(huán)血清混合于菌液中，靜置0.5min,觀察是否出現(xiàn)絮狀沉淀或顆粒狀凝塊，同時，用高壓抗原和0.5%石炭酸生理鹽水混合作對照，觀察有無自凝現(xiàn)象。

1.2.4 攻毒試驗

（1）大腸桿菌懸液制備

取分離菌的24純培養(yǎng)物培養(yǎng)5ml置于離心管，3000r/min離心15min，抽取上清液后，用5ml生理鹽水稀釋菌泥。充分搖勻，每1ml菌液中含有菌量約為6×108CUF,保存于4℃冰箱。

（2）對雞致病性試驗

把95只雛雞隨機(jī)分成19組，每組5只，把制備好的18株菌液分別接種于18組雞，每只雞經(jīng)口接種0.2ml大腸桿菌菌液，約為1.2×108CUF，另外一組雞做對照組，每只雞接種生理鹽水0.2ml。連續(xù)觀察7天，觀察實驗組及對照組雞的飲食，精神狀態(tài)，是否死亡等，7天后對所有雞進(jìn)行撲殺，并做病理解剖。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

從20份病料中分離得到18株大腸桿菌，分別命名為 X1、X2、X3、X4、X5、X6、D1、D2、D3、B1、B2、B3、N1、W1、W2、C1、C2、C3，分離率為 90%。分離菌均在普通瓊脂平板上長出表面光滑、濕潤、半透明、灰白色、圓形微凸起，中等大的菌落。在血液瓊脂平板上長出菌落較大，邊緣整齊，并有隆起的灰白色菌落，多數(shù)不溶血。均在麥康凱瓊脂平板上，形成中等大小的磚紅色菌落，在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，形成帶有金屬光澤的紫黑色菌落，在SS瓊脂上成粉紅色菌落。在肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h后，呈均勻混濁，管底有淡白色粘稠沉淀，管壁液面有菌環(huán)。

2.2 染色鏡檢的結(jié)果

病料及培養(yǎng)物涂片革蘭氏染色鏡檢均可見兩端純圓，多數(shù)散在排列，革蘭氏陰性短桿菌。

2.3 生化試驗結(jié)果

18株分離菌生化試驗結(jié)果表明，分離菌均符合大腸桿菌的生化特性，對硫化氫、苯丙氨酸、尿素、丙二酸鹽、V-P、枸櫞酸鹽的生化反應(yīng)呈陰性，對山梨醇、賴氨酸、靛基質(zhì)反應(yīng)呈陽性，有10株菌（占55.6%）對鳥氨酸生化反應(yīng)呈陽性，8株菌（占44.4%）呈陰性。如表1。

表1 18株分離菌的生化試驗結(jié)果

該結(jié)果經(jīng)查閱腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊（15系統(tǒng)）知，編碼分別為0124和0134，鑒定值分別為68.82%和93.71%，對應(yīng)菌名均為大腸桿菌。

2.4 血清型鑒定結(jié)果

在分離的18株大腸桿菌中，除1株未定型外，共確定了6個血清型，分別是O78、O2、O88、O57、O100和 O35。血清型 O78為 5株，占27.78%；O2為4株，占22.22%；O57為3株，占16.67%；O88為2株，占11.11%；O35為2株，占11.11%；O100為1株，占5.56%；未定型的1株。其中，O78、O2、O57為扎蘭屯地區(qū)的主要血清型，占定型總數(shù)的66.67%，如表2。

表2 18株大腸桿菌的血清型鑒定結(jié)果

2.5 攻毒試驗結(jié)果

將攻毒菌液接種雛雞后，均表現(xiàn)為精神沉郁、食欲下降或廢絕、垂翅、呼吸困難等，在12h以后，雛雞大量死亡，在7d內(nèi)，有82只雞死亡，死亡率為86.32%，對照組雛雞全部存活。剖檢死亡雛雞，表現(xiàn)為敗血癥、纖維素性心包炎、心包積液、肝周炎。從死亡的雛雞肝、心、脾等臟器回收菌的形態(tài)染色、生化特性與接種菌完全一致。

3 討論

本次試驗從扎蘭屯地區(qū)六個雞場中的20只病死雞中分離出18株大腸桿菌，經(jīng)過染色鏡檢、菌落形態(tài)判斷，和生化鑒定，均符合大腸桿菌的特征。說明根據(jù)大腸桿菌病的臨床癥狀和病理變化來判斷，絕大多數(shù)雞為大腸桿菌感染。

動物致病性回歸試驗表明，再次接種分離菌株的雞，出現(xiàn)了典型的大腸桿菌病臨床特征，解剖病死雞觀察，基本符合大腸桿菌病的病理變化，再次從病死雞血液、肝臟、脾臟中分離菌株，經(jīng)過鑒定，符合大腸桿菌的特征。接種后的雛雞，有的很快死亡，有的過幾天死亡，甚至有的雛雞耐過，說明分離出的18株大腸桿菌，有的致病性很強(qiáng)，有的致病性稍弱。

18株大腸桿菌進(jìn)行了血清型鑒定，除一株未定型外，17株菌分屬6個血清型，分別是O78、O2、O88、O57、O100 和 O35，其中 O78 為 5 株，占27.78%；O2為4株，占22.22%；O57為3株，占16.67%，這三個血清型確定為本地大腸桿菌主要血清型，一共占鑒定菌株的66.67%，其中O78、O2兩個血清型與文獻(xiàn)上報道的大腸桿菌主要血清型相一致，而O57這一血清型和以前文獻(xiàn)上報到的血清型比較是不常見的。

（作者單位：張金寶，內(nèi)蒙古扎蘭屯農(nóng)牧學(xué)校教務(wù)科；白寶霞，內(nèi)蒙古呼倫貝爾市新巴爾虎右旗獸醫(yī)局）

（編輯 王旸）